5-硝基-2-3-苯丙胺苯甲酸（NPPB）对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症因子表达的作用及机制研究

发布时间：2017-05-09 08:10

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【摘要】：目的:5-硝基-2-3-苯丙胺苯甲酸(NPPB)属芳香族酸类非特异性氯通道阻断剂,同时其也是G蛋白偶联受体(GPCRs)家族中GPR35的激动剂,而氯离子通道与G蛋白偶联受体均与炎症有着密切的关系。近来的研究表明:炎症因子可激活血管内皮细胞氯电流,并且此电流依赖于Cl C-3氯通道的表达;而氯通道阻断剂、沉默Cl C-3氯通道蛋白以及Cl C-3基因敲除均可明显抑制内皮细胞粘附分子的表达,抑制单核细胞向内皮细胞的粘附;Cl C-3基因敲除可抑制炎症因子诱导的血管内皮细胞核转录因子-κB(NF-κB)的活化,这些均提示Cl C-3氯通道参与了炎症的过程,其调控的炎症通路可能为NF-κB信号通路。而GPR35在多种免疫细胞均有表达,与MAPK炎症通路的激活密切相关,且参与了某些炎症相关性疾病的发生,提示GPR35可能起到促进炎症的作用。NPPB兼有氯通道阻断剂和GPR35激动剂的双重作用,其在血管内炎症应答的作用机制已有较多的研究报道,而在巨噬细胞炎症应答中的作用及其机制究竟如何,目前尚未报道。因此本课题旨在探讨NPPB对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞炎症因子的作用,并明确其作为氯通道阻断剂和GPR35激动剂对炎症因子的内在调控机制。方法:1.Western blot和荧光定量PCR检测NPPB对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的作用;2.荧光定量PCR检测Cl C家族氯通道蛋白m RNA在巨噬细胞上的表达情况;3.免疫荧光法检测Cl C-3氯通道蛋白在巨噬细胞中的分布情况;4.si RNA沉默Cl C-3氯通道蛋白检测其对LPS诱导的巨噬细胞炎症应答的影响;5.Western blot检测其它氯通道阻断剂对LPS诱导的巨噬细胞细胞炎症因子表达的影响;6.Western blot检测NPPB对LPS诱导的巨噬细胞NF-κB、p38 MAPK、ERK、JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平的影响;7.Western blot检测GPR35激动剂对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的作用。结果:1.NPPB可上调由LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症因子蛋白质、m RNA的表达。2.Cl C-3氯通道蛋白在RAW264.7细胞上的表达明显高于其它Cl C氯通道亚型。3.沉默Cl C-3氯通道蛋白可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α的表达。4.不同氯通道阻断剂对LPS诱导的TNF-α表达的影响不同。5.NPPB下调LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB磷酸化水平。6.GPR35激动剂可上调LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α的表达。7.NPPB上调LPS诱导的RAW264.7细胞p38 MAPK磷酸化水平。结论:1.NPPB在基因、蛋白水平均可上调由LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症因子的表达。2.Cl C-3氯通道可能不是NPPB上调LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α表达的靶点。3.NPPB促进LPS诱导的巨噬细胞TNF-α的表达可能是通过激活GPR35,其调控通路为p38 MAPK炎症通路。
【关键词】：5-硝基-2-3-苯丙胺苯甲酸 肿瘤坏死因子-α 氯通道 G蛋白偶联受体35 丝裂原激活的蛋白激酶p38
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-21
• 1. 研究背景9-19
• 1.1 巨噬细胞、脂多糖与炎症反应的相关性9-14
• 1.2 氯离子通道与炎症反应的关系14-17
• 1.3 G蛋白偶联受体与炎症反应的关系17-18
• 1.4 5-硝基23-苯丙胺苯甲酸（NPPB）18-19
• 2．本课题的思路、研究目的和意义19-21
• 材料与方法21-33
• 1 材料21-27
• 1.1 小鼠巨噬细胞系RAW264.721
• 1.2 主要仪器和设备21-22
• 1.3 主要药品和试剂22-27
• 2 方法27-33
• 2.1 细胞培养27
• 2.2 Western blot检测目的蛋白表达27-30
• 2.3 荧光定量PCR检测炎症因子m RNA的表达30-31
• 2.4 荧光定量PCR检测Cl C家族氯通道蛋白m RNA的表达情况31
• 2.5 免疫荧光检测Cl C-3 氯通道蛋白的分布情况31-32
• 2.6 si RNA细胞转染下调Cl C-3 氯通道蛋白表达32
• 2.7 统计分析32-33
• 结果33-45
• 1. NPPB对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7 炎症因子表达的作用33-36
• 1.1 NPPB上调LPS诱导的RAW264.7 细胞的TNF-α蛋白质表达33-34
• 1.2 NPPB上调LPS诱导的RAW264.7 细胞的TNF-α m RNA表达34-35
• 1.3 NPPB上调LPS诱导的RAW264.7 细胞的IL-6 m RNA表达35-36
• 2. NPPB作为氯通道阻断剂在LPS诱导的RAW264.7 细胞炎症应答中的作用36-42
• 2.1 不同氯通道阻断剂对LPS诱导的RAW264.7 细胞TNF-α的表达影响有差异36-37
• 2.2 RAW264.7 细胞Cl C氯通道家族m RNA表达情况37-38
• 2.3 RAW264.7 细胞Cl C-3 氯通道蛋白分布情况38-39
• 2.4 沉默Cl C-3 氯通道蛋白对LPS诱导的RAW264.7 细胞TNF-α的表达的作用39-41
• 2.5 NPPB下调LPS诱导的RAW264.7 细胞NF-κB磷酸化水平41-42
• 3. NPPB作为GPR35激动剂在LPS诱导的RAW264.7 细胞炎症应答中的作用42-45
• 3.1 GPR35受体激动剂上调LPS诱导炎症因子TNF-α的表达42-43
• 3.2 NPPB上调LPS诱导的RAW264.7 细胞p38 MAPK磷酸化水平43-44
• 3.3 NPPB对LPS诱导的RAW264.7 炎症应答中MAPK信号通路其它关键蛋白的作用44-45
• 讨论45-49
• 全文结论49-50
• 总结与展望50-51
• 参考文献51-58
• 附录 主要缩略词表58-59
• 在校期间发表论文及科研情况59-60
• 致谢60-61

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