重组大肠杆菌中1,2,4-丁三醇合成途径的构建和优化

发布时间：2017-05-09 15:08

  本文关键词：重组大肠杆菌中1,2,4-丁三醇合成途径的构建和优化，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：1,2,4-丁三醇(1,2,4-butanetriol,简称BT)是一种重要的非天然多元醇,在医药、军工等领域具有广泛的应用价值。医药方面,丁三醇可被用作阳离子脂质体和多种手性药物的合成前体。丁三醇最有潜力的应用是作为1,2,4-丁三醇三硝酸酯(1,2,4-butanetriol trinitrate,BTTN)的合成前体,后者可代替硝化甘油作为推进剂和含能增塑剂,并具有更优的理化性质。此外,丁三醇还可用于合成聚氨酯泡沫、卷烟添加剂和彩色显影剂,等等。目前1,2,4-丁三醇的商业生产多采用化学合成法,存在反应条件苛刻、环境污染严重、生产危险性大、副产物多等弊端。近年来,越来越多的人将目光投向了利用成本低廉的原料,以反应条件温和、对环境友好且安全高效的生物合成法。目前已有研究者成功建立了用大肠杆菌转化木糖生产1,2,4-丁三醇的菌株和工艺。但从已有报道来看,用重组E.coli转化木糖生产丁三醇的催化效率较低,这导致丁三醇产量远无法满足工业规模生产的需求。如果要进一步提高1,2,4-丁三醇的转化效率,首先必须对丁三醇的合成途径进行系统的优化,找出催化限速步骤,精确调节催化各个步骤酶的表达量,以实现最大的转化通量。本文首先通过yag E、yjh H、yia E、ycd W和xyl AB等旁路基因的敲除,以及来自新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)的D-木糖脱氢酶的编码基因xdh和来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的苯甲酰甲酸脱羧酶编码基因mdl C在E.coli BW25113中的异源表达,成功构建了能够利用D-木糖合成0.30 g/L 1,2,4-丁三醇的重组菌株BW-011。为提高1,2,4-丁三醇的产量,我们分析了此合成途径的限速步骤,并针对途径中的第三步——3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸脱羧反应进行了新的不同来源2-酮酸脱羧酶的筛选和表达。摇瓶转化结果显示,对于上述目标反应,来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的α-酮异戊酸脱羧酶(Kiv D)具有比Mdl C有更高的催化效率,表达Kiv D的重组菌株BW-025的丁三醇产量也达到了BW-011的3倍。之后我们对Kiv D进行了理性设计,旨在进一步提高Kiv D对目标反应的催化活性。与此同时,我们分别调节了BW-025的1,2,4-丁三醇合成途径中各个步骤酶的表达量,以实现途径转化通量的提高,并发掘途径中新的限速步骤。通过诱导型过表达xdh,我们最终获得了1,2,4-丁三醇产量较BW-025提高了48.62%的重组菌株BW-074。此外,本文还探究了不同转化条件对重组菌株1,2,4-丁三醇合成的影响。通过对培养基、温度、初始菌量、p H和供氧等转化条件的优化,BW-025转化72 h丁三醇的最高产量被提升至2.38 g/L。通过以上工作,本研究显著提高了重组菌株利用木糖合成1,2,4-丁三醇的效率,并为之后生物法合成丁三醇的工作奠定了基础并提供了一种方向。
【关键词】：D-木糖 1 2 4-丁三醇 大肠杆菌 2-酮酸脱羧酶 理性设计 途径优化
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914.5
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 绪论7-13
• 1.1 1,2,4-丁三醇7-10
• 1.1.1 1,2,4-丁三醇的理化性质7
• 1.1.2 1,2,4-丁三醇的用途7
• 1.1.3 1,2,4-丁三醇的化学法合成7-8
• 1.1.4 1,2,4-丁三醇的生物法合成8-10
• 1.2 代谢工程10
• 1.3 研究意义及主要研究内容10-13
• 1.3.1 研究意义10-11
• 1.3.2 研究内容11-13
• 第二章 大肠杆菌中 1,2,4-丁三醇合成途径的初步构建和表达13-35
• 2.1 实验材料14-16
• 2.1.1 质粒和菌株14
• 2.1.2 引物14-15
• 2.1.3 培养基15-16
• 2.1.4 酶与试剂16
• 2.2 实验方法16-27
• 2.2.1 常规分子实验操作16-20
• 2.2.2 BW-004的构建20-22
• 2.2.3 BW-010的构建22-25
• 2.2.4 重组大肠杆菌BW-011的构建25-26
• 2.2.5 菌株的培养和转化26-27
• 2.2.6 代谢产物的检测分析27
• 2.3 实验结果27-33
• 2.3.1 BW-004的构建27-30
• 2.3.2 BW-010的构建30-31
• 2.3.3 BW-011的构建31-32
• 2.3.4 BW-011的摇瓶转化32-33
• 2.4 本章小结33-35
• 第三章 大肠杆菌合成 1,2,4-丁三醇的途径优化35-53
• 3.1 实验材料35-37
• 3.1.1 质粒和菌株35
• 3.1.2 引物35-36
• 3.1.3 培养基36-37
• 3.1.4 酶与试剂37
• 3.2 实验方法37-43
• 3.2.1 对新 2-酮酸脱羧酶的筛选37
• 3.2.2 KivD的理性设计37
• 3.2.3 重组质粒的构建37-42
• 3.2.4 重组菌株的构建42
• 3.2.5 质粒的化学转化42
• 3.2.6 菌株的培养和转化42-43
• 3.3 实验结果43-50
• 3.3.1 对新 2-酮酸脱羧酶的筛选43
• 3.3.2 KivD的理性设计43-49
• 3.3.3 1,2,4-丁三醇合成途径中各步酶的表达量的精确调节49-50
• 3.4 本章小结50-53
• 第四章 转化条件对 1,2,4-丁三醇合成的影响53-64
• 4.1 实验材料53
• 4.1.1 菌株53
• 4.1.2 培养基53
• 4.1.3 试剂53
• 4.2 实验方法53-55
• 4.2.1 菌株的培养和转化53-54
• 4.2.2 代谢产物的检测分析54
• 4.2.3 菌株生长情况分析54
• 4.2.4 SDS-PAGE54-55
• 4.3 实验结果55-63
• 4.3.1 不同转化体系对 1,2,4-丁三醇合成的影响55-57
• 4.3.2 不同转化条件对 1,2,4-丁三醇合成的影响57-62
• 4.3.3 优化条件下的 1,2,4-丁三醇合成情况62-63
• 4.4 本章小结63-64
• 主要结论与展望64-66
• 主要结论64-65
• 展望65-66
• 致谢66-68
• 参考文献68-72
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文72-73
• 附录: 论文中主要基因序列73-81

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 田林祥;1,2,4-丁三醇的高效液相色谱分析[J];火炸药学报;2001年02期

2 蔡征宇;王明亮;;(S)-3-羟基-γ-丁内酯一步法合成(S)-1,2,4-丁三醇的研究[J];合肥工业大学学报(自然科学版);2010年06期

3 徐松林;阳世清;;国外含能材料的生物合成研究进展[J];化学通报;2007年08期

4 金锐;;同源重组的好工具,Red重组系统[J];科教文汇(下旬刊);2007年10期

5 李赤峰,徐保国;1,2,4-丁三醇合成工艺述评[J];湖南化工;2000年03期

6 于慧敏;马玉超;;工业微生物代谢途径调控的基因敲除策略[J];生物工程学报;2010年09期

7 任力强;Ras蛋白异戊二烯化修饰与抗癌药物的设计[J];生命的化学(中国生物化学会通讯);1994年02期

8 韩聪,张惟材,游松;Red同源重组技术研究进展[J];中国生物工程杂志;2003年12期

9 赵学明,王靖宇,陈涛,陈洵,班睿,马红武;后基因组时代的代谢工程:机遇与挑战[J];生物加工过程;2004年02期

10 杨多;银屑病的药物治疗进展[J];天津药学;2000年04期

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本文编号：352707