针对柯萨奇病毒和埃博拉病毒的药物筛选及活性研究

发布时间：2017-05-09 15:17

  本文关键词：针对柯萨奇病毒和埃博拉病毒的药物筛选及活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：虽然科学技术的进步改变了我们的生存环境和生存空间,使得我们的生活更加丰富,便捷以及安逸,但全球性流行传染病却常常在提醒我们：我们生活在一个微生物的世界里,微生物(包括病毒,细菌,真菌等)以惊人的变异速度来适应和抵抗药物及人体免疫防御机制,导致感染疾病的大规模爆发和流行,因此我们必须加快新药研制的步伐,期望能获得活性好、毒副作用低的药物来预防和治疗病原菌感染引起的疾病。小分子化合物是药物候选物的重要来源,目前新药的研发仍然依赖基于靶点特异的筛选模型对大规模的化合物库筛选,从中发现活性化合物。本论文通过建立抗病毒筛选模型,从实验室前期构建的化合物库中寻找活性化合物,并对所筛选得到的活性化合物进行作用机制的初步研究。病毒的侵染过程一般可以分为吸附、吸附与进入、大分子合成、装配与释放5个阶段,从病毒与宿主细胞表面接触、释放核酸进入胞浆,到病毒的各个活性蛋白劫持宿主生物合成系统来完成自身结构蛋白和基因组的复制,以及最后的组装成子代病毒释放,这一系列的过程均可以作为药物设计的靶点。本论文针对两个重要病毒柯萨奇病毒(Coxsackie virus)和埃博拉病毒(Ebola virus)进行研究,它们都属于小RNA病毒,并且都对人类健康具有很大的危害性。其中埃博拉病毒包膜蛋白GP (Glycoprotein)在介导埃博拉病毒进入受体细胞过程中发挥重要作用。柯萨奇病毒B亚型的3C蛋白酶与小RNA病毒蛋白的剪切过程有关,对柯萨奇病毒在宿主细胞内的自我复制发挥着非常重要的作用,针对柯萨奇病毒B亚型的3C蛋白酶的抑制剂研究以及针对埃博拉病毒包膜蛋白GP的抑制剂的研究都是抗病毒药物的重要研究手段。本论文在此基础上,分别通过基于荧光共振能量转移(FRET)原理进行体外的CVB3-3C蛋白酶抑制剂筛选,以及基于报告基因荧光素酶(luciferase)对携带埃博拉囊膜蛋白的假病毒EBOV-GP进行了GP抑制剂的筛选。本论文通过高通量筛选,获得了7个具有较好活性的CVB3-3C蛋白酶非竞争性可逆抑制剂,以及7个有显著活性的EBOV-GP抑制剂,其中CVB3-3C蛋白酶抑制剂的IC50在2.5μM～7.73μM之间,与芦平曲韦(IC50=1.57μM)达到同一活性水平,显示出良好的3C蛋白酶抑制活性。同时所筛选到的EBOV-GP抑制剂的IC50范围为0.0257μM～1.071μM,其中化合物F0393-0147对EBOV-GP有特异性抑制效果。通过本论文的研究,我们基于特异高通量筛选模型,分别对CVB3-3C蛋白酶和EBOV-GP进行高通量药物筛选,从实验室具有自主知识产权的6000个化合物中筛选出了多个具有活性的化合物,并且这些化合物的细胞毒性很低。这些活性化合物的结构与已报道的小分子药物属于不同的类型,提示这些化合物可能有着新的作用机制。而且根据构效关系对这些化合物作进一步的结构优化之后,有希望获得活性更好、毒性更低的化合物,对于研发新型抗病毒药物提供了新的思路和素材,具有很好的启示作用。
【关键词】：心肌炎病毒 3C蛋白酶 埃博拉 GP蛋白 抑制剂 筛选 活性化合物
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R914
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一部分 前言11-20
• 1.1 药物筛选概述11
• 1.2 药物筛选技术的发展历程11-12
• 1.3 高通量药物筛选技术的研究现状12-14
• 1.3.1 分子水平上的高通量药物筛选模型13
• 1.3.2 细胞水平上的高通量药物筛选模型13-14
• 1.3.3 动物水平上的高通量药物筛选模型14
• 1.4 病毒感染性疾病与抗病毒药物的研究现状14-16
• 1.5 抗病毒药物的发展趋势16-18
• 1.5.1 抗肠道病毒药物的发展趋势17
• 1.5.2 抗埃博拉病毒药物的发展趋势17-18
• 1.6 本研究的目的以及意义18-20
• 第二部分 实验材料和方法20-31
• 2.1 质粒、菌株和细胞系20
• 2.2 实验所用培养基及溶液的配制20-22
• 2.3 实验仪器22-23
• 2.4 实验方法23-31
• 第三部分 柯萨奇病毒3C蛋白酶新型抑制剂的发现及其生物活性研究31-42
• 3.1 心肌炎病毒的背景介绍31
• 3.2 柯萨奇病毒B3亚型(CVB3)的3C蛋白酶抑制剂31-33
• 3.3 表达和纯化柯萨奇病毒B3亚型(CVB3)的3C蛋白酶33-34
• 3.4 基于荧光共振能量转移(FRET)原理进行3C蛋白酶抑制剂体外筛选34-37
• 3.5 对所筛到的活性化合物进行细胞毒性测试37
• 3.6 3C蛋白酶抑制剂的抑制剂类型的研究37-41
• 3.6.1 判断化合物是否是可逆抑制剂38-39
• 3.6.2 判断化合物哪种可逆抑制剂39-41
• 3.7 小结与展望41-42
• 第四部分 埃博拉病毒GP抑制剂的筛选42-51
• 4.1 埃博拉背景介绍42-43
• 4.2 埃博拉假病毒的构建43-45
• 4.3 埃博拉GP蛋白抑制剂的筛选45-50
• 4.4 小结与展望50-51
• 第五部分 总结与展望51-53
• 参考文献53-56
• 附录56-59
• 附录1 CVB3 3C基因序列56
• 附录2 EBOV2014-C07 GP基因序列56-59
• 致谢59-61
• 攻读硕士期间发表的学术论文目录61

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本文编号：352747