环吡酮胺和化合物A11抗缺血性脑卒中药效和机制研究
发布时间：2022-08-10 18:32
缺血性脑卒中是常见的心脑血管疾病,具有“高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率”的特点。该疾病严重威胁人类健康,给家庭和社会造成沉重的负担。然而,目前可用于临床的治疗药物却十分局限。因此寻找抗缺血性脑卒中的神经保护剂十分必要。本论文采用细胞表型筛选的方式,从已上市药物、化学合成小分子以及天然产物中寻找抗脑缺血损伤的新型、高效、机制新颖的活性化合物。本论文的第一部分内容是抗真菌药物环吡酮胺的抗脑缺血作用发现、药效评价及药理机制研究。首先应用模拟临床脑缺血再灌注损伤的快速表型筛选模型——氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）损伤SH-SY5Y细胞模型,对778个已上市药物进行活性测试,发现抗真菌药物环吡酮胺具有显著对抗缺血诱发神经细胞损伤的作用。环吡酮胺是抗真菌药物,临床上广泛用于治疗表皮真菌感染,其对抗脑缺血再灌注诱发的神经损伤作用尚未有文献报道。论文首先证实环吡酮胺浓度依赖地改善氧糖剥夺以及氧化应激诱发SH-SY5Y神经细胞损伤。在大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型中,再灌注时静脉给予环...
【文章页数】：120 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 引言
1.1 脑卒中概况
1.2 缺血性脑卒中的多环节病理机制
1.3 抗缺血性脑卒中药物研发现状
1.4 表型筛选在药物研发中的优势
1.5 已上市药物和结构新颖多样小分子是药物研发的重要来源
1.6 新技术涌现为高效发现药物靶标带来曙光
第2章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 活性化合物信息
2.1.2 细胞系
2.1.3 实验动物
2.1.4 主要试剂耗材
2.1.5 化合物配制
2.1.6 试剂配制
2.1.7 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 SH-SY5Y细胞氧糖剥夺(OGD)损伤模型构建
2.2.2 SH-SY5Y细胞H2O2损伤模型构建
2.2.3 HT-22细胞谷氨酸损伤模型建立
2.2.4 细胞内LDH释放量检测
2.2.5 细胞内ATP(三磷酸腺苷)的检测
2.2.6 流式法检测细胞内活性氧(ROS)
2.2.7 细胞凋亡检测
2.2.8 核蛋白提取
2.2.9 蛋白质免疫印迹
2.2.10 大鼠MCAO模型
2.2.11 大鼠脑梗死面积测定
2.2.12 脑组织含水量测定
2.2.13 神经行为学(mNSS)评分
2.2.14 ELISA检测炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)
2.2.15 组织化学
2.2.16 免疫荧光染色(NeuN、GFAP、Iba-1、ZO-1和CD31)
2.2.17 Tunel染色
2.2.18 Evansblue血脑屏障完整性检测
2.2.19 Rotarod转棒测试运动协调能力
2.2.20 抗体芯片检测
2.2.21 磷酸化蛋白质组学
2.2.22 Griess法检测亚硝酸盐
2.2.23 细胞周期检测
2.2.24 探针靶标垂钓
2.2.25 统计方法
第3章 实验结果与讨论
第一部分 环吡酮胺抗脑缺血损伤药效和机制研究
3.1.1 环吡酮胺抗脑缺血损伤作用发现和体内外药效评价
3.1.1.1 采用表型筛选模型发现新型抗脑缺血活性小分子——老药环吡酮胺
3.1.1.2 环吡酮胺在细胞氧糖剥夺和氧化应激模型中量效关系
3.1.1.3 再灌注时单次给予环吡酮胺降低MCAO术后大鼠脑梗死体积并改善脑水肿
3.1.1.4 环吡酮胺改善MCAO术后大鼠神经功能
3.1.1.5 环吡酮胺减少MCAO术后大鼠脑内神经元缺失
3.1.1.6 连续给予环吡酮胺7天改善MCAO术后大鼠运动功能
3.1.1.7 连续给予环吡酮胺对MCAO术后大鼠存活情况的影响
3.1.2 环吡酮胺对缺血再灌注诱发多重病理环节的干预作用
3.1.2.1 环吡酮胺抑制MCAO诱发的脑内细胞凋亡
3.1.2.2 环吡酮胺抑制MCAO诱发的脑内胶质细胞激活
3.1.2.3 环吡酮胺减少MCAO术后脑内炎性细胞因子的表达
3.1.2.4 环吡酮胺抑制MCAO术后脑内COX-2高表达
3.1.2.5 环吡酮胺保护MCAO大鼠血脑屏障的完整性
3.1.2.6 环吡酮胺对血管内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响
3.1.3 环吡酮胺药理机制研究
3.1.3.1 环吡酮胺上调OGD处理后细胞内HIF-1α表达
3.1.3.2 外源性铁剂对环吡酮胺上调细胞内HIF-1α及其保护作用的影响
3.1.3.3 环吡酮胺对细胞内蛋白磷酸化水平的影响
3.1.3.4 环吡酮胺对OGD处理后细胞内AKT,GSK-3β,mTOR,以及p70S6K磷酸化水平的影响
3.1.3.5 磷酸化蛋白质组学实验流程及数据整理
3.1.3.6 差异磷酸化蛋白的GO分析
3.1.3.7 差异磷酸化蛋白KEGG信号通路富集分析
3.1.3.8 差异磷酸化蛋白富集在调控细胞周期信号通路
3.1.3.9 环吡酮胺对LPS激活BV-2细胞周期的影响
3.1.3.10 连接生物素对环吡酮细胞保护作用的影响
3.1.3.11 阳性探针和阴性探针分子在细胞OGD模型上的药效比较
3.1.3.12 阳性探针分子和阴性探针分子的差异结合蛋白
3.1.4 讨论
3.1.5 小结
第二部分 二芳基酰腙类衍生物A11抗脑缺血损伤药效和机制研究
3.2.1 A11在脑缺血损伤的体内外模型中药效评价
3.2.1.1 二芳基酰腙类衍生物抗缺血损伤活性的发现
3.2.1.2 A11保护SH-SY5Y细胞免受OGD损伤
3.2.1.3 A11减少MCAO术后大鼠脑梗死体积并改善神经功能
3.2.2 A11对脑缺血损伤多重病理环节的干预作用
3.2.2.1 A11减轻氧化应激诱导的神经细胞死亡
3.2.2.2 A11抑制OGD诱导的细胞凋亡
3.2.2.3 A11减轻OGD诱导的线粒体功能障碍
3.2.3 A11保护作用机制研究
3.2.3.1 OGD损伤后不同时间点细胞内AKT和ERK磷酸化水平变化情况
3.2.3.2 A11抑制OGD诱导的细胞内ERK磷酸化水平的下调并上调AKT磷酸化水平
3.2.3.3 A11通过激活MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路发挥保护作用
3.2.4 讨论
3.2.5 小结
第4章 结论
4.1 环吡酮胺的抗脑缺血药理药效
4.2 二芳基酰腙类衍生物A11抗脑缺血药理药效
参考文献
附录 缩略词表
致谢
作者简历及攻读学位期间的学术论文与研究成果
本文编号：3674143
【文章页数】：120 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 引言
1.1 脑卒中概况
1.2 缺血性脑卒中的多环节病理机制
1.3 抗缺血性脑卒中药物研发现状
1.4 表型筛选在药物研发中的优势
1.5 已上市药物和结构新颖多样小分子是药物研发的重要来源
1.6 新技术涌现为高效发现药物靶标带来曙光
第2章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 活性化合物信息
2.1.2 细胞系
2.1.3 实验动物
2.1.4 主要试剂耗材
2.1.5 化合物配制
2.1.6 试剂配制
2.1.7 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 SH-SY5Y细胞氧糖剥夺(OGD)损伤模型构建
2.2.2 SH-SY5Y细胞H2O2损伤模型构建
2.2.3 HT-22细胞谷氨酸损伤模型建立
2.2.4 细胞内LDH释放量检测
2.2.5 细胞内ATP(三磷酸腺苷)的检测
2.2.6 流式法检测细胞内活性氧(ROS)
2.2.7 细胞凋亡检测
2.2.8 核蛋白提取
2.2.9 蛋白质免疫印迹
2.2.10 大鼠MCAO模型
2.2.11 大鼠脑梗死面积测定
2.2.12 脑组织含水量测定
2.2.13 神经行为学(mNSS)评分
2.2.14 ELISA检测炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)
2.2.15 组织化学
2.2.16 免疫荧光染色(NeuN、GFAP、Iba-1、ZO-1和CD31)
2.2.17 Tunel染色
2.2.18 Evansblue血脑屏障完整性检测
2.2.19 Rotarod转棒测试运动协调能力
2.2.20 抗体芯片检测
2.2.21 磷酸化蛋白质组学
2.2.22 Griess法检测亚硝酸盐
2.2.23 细胞周期检测
2.2.24 探针靶标垂钓
2.2.25 统计方法
第3章 实验结果与讨论
第一部分 环吡酮胺抗脑缺血损伤药效和机制研究
3.1.1 环吡酮胺抗脑缺血损伤作用发现和体内外药效评价
3.1.1.1 采用表型筛选模型发现新型抗脑缺血活性小分子——老药环吡酮胺
3.1.1.2 环吡酮胺在细胞氧糖剥夺和氧化应激模型中量效关系
3.1.1.3 再灌注时单次给予环吡酮胺降低MCAO术后大鼠脑梗死体积并改善脑水肿
3.1.1.4 环吡酮胺改善MCAO术后大鼠神经功能
3.1.1.5 环吡酮胺减少MCAO术后大鼠脑内神经元缺失
3.1.1.6 连续给予环吡酮胺7天改善MCAO术后大鼠运动功能
3.1.1.7 连续给予环吡酮胺对MCAO术后大鼠存活情况的影响
3.1.2 环吡酮胺对缺血再灌注诱发多重病理环节的干预作用
3.1.2.1 环吡酮胺抑制MCAO诱发的脑内细胞凋亡
3.1.2.2 环吡酮胺抑制MCAO诱发的脑内胶质细胞激活
3.1.2.3 环吡酮胺减少MCAO术后脑内炎性细胞因子的表达
3.1.2.4 环吡酮胺抑制MCAO术后脑内COX-2高表达
3.1.2.5 环吡酮胺保护MCAO大鼠血脑屏障的完整性
3.1.2.6 环吡酮胺对血管内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响
3.1.3 环吡酮胺药理机制研究
3.1.3.1 环吡酮胺上调OGD处理后细胞内HIF-1α表达
3.1.3.2 外源性铁剂对环吡酮胺上调细胞内HIF-1α及其保护作用的影响
3.1.3.3 环吡酮胺对细胞内蛋白磷酸化水平的影响
3.1.3.4 环吡酮胺对OGD处理后细胞内AKT,GSK-3β,mTOR,以及p70S6K磷酸化水平的影响
3.1.3.5 磷酸化蛋白质组学实验流程及数据整理
3.1.3.6 差异磷酸化蛋白的GO分析
3.1.3.7 差异磷酸化蛋白KEGG信号通路富集分析
3.1.3.8 差异磷酸化蛋白富集在调控细胞周期信号通路
3.1.3.9 环吡酮胺对LPS激活BV-2细胞周期的影响
3.1.3.10 连接生物素对环吡酮细胞保护作用的影响
3.1.3.11 阳性探针和阴性探针分子在细胞OGD模型上的药效比较
3.1.3.12 阳性探针分子和阴性探针分子的差异结合蛋白
3.1.4 讨论
3.1.5 小结
第二部分 二芳基酰腙类衍生物A11抗脑缺血损伤药效和机制研究
3.2.1 A11在脑缺血损伤的体内外模型中药效评价
3.2.1.1 二芳基酰腙类衍生物抗缺血损伤活性的发现
3.2.1.2 A11保护SH-SY5Y细胞免受OGD损伤
3.2.1.3 A11减少MCAO术后大鼠脑梗死体积并改善神经功能
3.2.2 A11对脑缺血损伤多重病理环节的干预作用
3.2.2.1 A11减轻氧化应激诱导的神经细胞死亡
3.2.2.2 A11抑制OGD诱导的细胞凋亡
3.2.2.3 A11减轻OGD诱导的线粒体功能障碍
3.2.3 A11保护作用机制研究
3.2.3.1 OGD损伤后不同时间点细胞内AKT和ERK磷酸化水平变化情况
3.2.3.2 A11抑制OGD诱导的细胞内ERK磷酸化水平的下调并上调AKT磷酸化水平
3.2.3.3 A11通过激活MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路发挥保护作用
3.2.4 讨论
3.2.5 小结
第4章 结论
4.1 环吡酮胺的抗脑缺血药理药效
4.2 二芳基酰腙类衍生物A11抗脑缺血药理药效
参考文献
附录 缩略词表
致谢
作者简历及攻读学位期间的学术论文与研究成果
本文编号：3674143
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