抗菌肽W3R6对于耻垢分枝杆菌的抗菌活性及其作用机制的研究

发布时间：2022-12-04 08:44

　　结核病（TB）是由结核杆菌感染引起的慢性传染性疾病,结核病对全球健康构成持久威胁,目前全球近1/3人口患有潜伏性结核病,每年有近180万人因结核病死亡。近40年内,除了贝达喹啉和德拉玛尼外没有新药的出现,因此迫切需要具有新作用机理的药物。拥有独特杀菌机理且使微生物不易产生耐药性的抗菌肽有望成为抗分枝杆菌感染的潜在药物。对实验室现有的抗菌肽进行筛选,发现D型、L型和D/L型三种构型抗菌肽W3R6对耻垢分枝杆菌（ATCC 700084）（Mycobacterium smegmatis,M.s）的最小抑菌浓度分别为6.25μM、12.5μM和6.25μM,对抗菌肽进行改造,在D型W3R6的N端链接了疏水脂肪链基团乙酰基、丁酸酰基、正辛酸酰基、月桂酸酰基和棕榈酸酰基,以期通过疏水性的调整增强抗菌活性,结果发现,AC-D-W3R6和BA-D-W3R6的MIC值均降为3.13μM,但是随着疏水性的增加,抗菌肽OA-D-W3R6、LA-D-W3R6和PA-D-W3R6的细胞毒性也逐渐增强,因此本论文选择了活性较好且细胞毒性较弱的抗菌肽W3R6及其改造肽,以分枝杆菌的实验室模式菌耻垢分枝杆菌为研究对象... 

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 综述
    1.1 结核病简介
        1.1.1 结核病的现状
        1.1.2 结核病治疗的发展史
        1.1.3 一线抗结核药物的作用机制
    1.2 分枝杆菌简介
        1.2.1 分枝杆菌的生长特性
        1.2.2 结核分枝杆菌的致病过程
        1.2.3 结核分枝杆菌的细胞壁
    1.3 抗菌肽与分枝杆菌相互作用
        1.3.1 抗菌肽的天然分类和理化性质
        1.3.2 抗菌肽的结构与活性关系
        1.3.3 抗菌肽的作用机制
2 抗菌肽的筛选及改造
    2.1 实验材料和仪器
        2.1.1 多肽的合成
        2.1.2 主要材料和试剂
        2.1.3 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 耻垢分枝杆菌的复苏、传代和菌种保存
        2.2.2 抗菌肽对于耻垢分枝杆菌的最小抑菌浓度实验
        2.2.3 W3R6系列抗菌肽的改造
        2.2.4 改造后的W3R6系列抗菌肽对耻垢分枝杆菌的最小抑菌浓度实验
        2.2.5 抗菌肽W3R6及其改造肽溶血活性的检测
        2.2.6 抗菌肽W3R6及其改造肽对于THP-1细胞活力的影响
    2.3 实验结果
        2.3.1 抗菌肽对于耻垢分枝杆菌的抗菌活性
        2.3.2 W3R6系列抗菌肽的改造合成
        2.3.3 抗菌肽W3R6及其改造肽的抗分枝杆菌活性
        2.3.4 抗菌肽W3R6及其改造肽的细胞毒性
    2.4 讨论
3 抗菌肽W3R6及其改造肽的抗分枝杆菌活性及稳定性
    3.1 实验材料和仪器
        3.1.1 多肽的合成
        3.1.2 主要材料和试剂
        3.1.3 主要仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 抗菌肽W3R6 及其改造肽对H37Ra和 BCG的最小抑菌浓度实验
        3.2.2 抗菌肽W3R6及其改造肽杀菌动力学实验
        3.2.3 抗菌肽W3R6及其改造肽对于胞内生长的耻垢分枝杆菌的杀菌活性检测
        3.2.4 棋盘微量稀释法检测抗菌肽W3R6及其改造肽与抗生素的联合作用
        3.2.5 发展耐药性实验
        3.2.6 圆二色谱法检测抗菌肽W3R6及其改造肽的二级结构
        3.2.7 RT-HPLC法检测抗菌肽W3R6 及其改造肽在人血清环境中的稳定性
    3.3 实验结果
        3.3.1 抗菌肽W3R6 及其改造肽对H37Ra和 BCG的抗菌活性
        3.3.2 抗菌肽W3R6及其改造肽杀菌动力学
        3.3.3 抗菌肽W3R6及其改造肽对于胞内生长的耻垢分枝杆菌的杀菌活性
        3.3.4 抗菌肽W3R6及其改造肽与抗生素的联合作用
        3.3.5 发展耐药性实验
        3.3.6 抗菌肽W3R6及其改造肽的二级结构
        3.3.7 抗菌肽W3R6及其改造肽在人血清环境中的稳定性
    3.4 讨论
4 抗菌肽W3R6及其改造肽的膜作用机制
    4.1 实验材料和仪器
        4.1.1 多肽的合成
        4.1.2 主要材料和试剂
        4.1.3 主要仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 LIVE/DEAD试剂盒法检测抗菌肽W3R6 及其改造肽对耻垢分枝杆菌细胞膜的影响
        4.2.2 扫描电镜实验观察抗菌肽W3R6及其改造肽对耻垢分枝杆菌细胞膜的影响
        4.2.3 Zeta电位检测抗菌肽W3R6 及其改造肽与耻垢分枝杆菌的结合情况
        4.2.4 NPN实验检测抗菌肽W3R6及其改造肽对耻垢分枝杆菌外膜通透性的影响
        4.2.5 去极化实验检测抗菌肽W3R6及其改造肽对耻垢分枝杆菌内膜通透性的影响
        4.2.6 钙黄绿素释放实验检测抗菌肽W3R6及其改造肽对分枝杆菌内膜模拟膜的影响
    4.3 实验结果
        4.3.1 激光扫描共焦显微镜观察抗菌肽对耻垢分枝杆菌细胞膜的影响
        4.3.2 扫描电镜下观察抗菌肽W3R6及其改造肽对耻垢分枝杆菌形态的影响
        4.3.3 抗菌肽W3R6及其改造肽与耻垢分枝杆菌结合情况
        4.3.4 抗菌肽W3R6及其改造肽对耻垢分枝杆菌外膜通透性的影响
        4.3.5 抗菌肽W3R6及其改造肽对耻垢分枝杆菌内膜的影响
    4.4 讨论
5 抗菌肽W3R6及其改造肽与耻垢分枝杆菌基因组DNA的相互作用
    5.1 实验材料和仪器
        5.1.1 多肽的合成
        5.1.2 主要材料和试剂
        5.1.3 主要仪器
    5.2 实验方法
        5.2.1 CLSM观察抗菌肽D-W3R6 与耻垢分枝杆菌的共定位情况
        5.2.2 CTAB法提取耻垢分枝杆菌基因组DNA
        5.2.3 琼脂糖凝胶电泳实验检测抗菌肽W3R6及其改造肽与耻垢分枝杆菌基因组DNA的结合情况
        5.2.4 紫外光谱法检测抗菌肽W3R6及其改造肽与耻垢分枝杆菌基因组DNA的结合方式
    5.3 实验结果
        5.3.1 抗菌肽D-W3R6与耻垢分枝杆菌的共定位
        5.3.2 抗菌肽W3R6及其改造肽与耻垢分枝杆菌基因组DNA的结合
        5.3.3 抗菌肽W3R6及其改造肽与耻垢分枝杆菌基因组DNA的结合方式
    5.4 讨论
结论
参考文献
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢



本文编号：3707946