p38α与Nur77相互作用的结构基础以及基于p38α的药物筛选

发布时间：2023-03-05 15:43

　　p38α是一种丝裂原活化蛋白激酶(MAPK),其涉及的信号通路与细胞炎症、细胞凋亡、细胞分化、心肌肥大、细胞周期密切相关,这也让p38α成为具吸引力的药物设计靶标。核受体涉及细胞的生长、发育、稳态以及其他多种生理活动,在癌症、炎症、代谢和增生性疾病中起着基础性作用。孤儿核受体Nur77作为其中的重要一员,也引起研究者的广泛关注。前期研究发现p38α与Nur77存在相互作用,会导致LPS所诱导的炎症反应,但Nur77与p38α的作用模式目前还缺乏研究。本课题以此为出发点,通过结构生物学研究揭示p38α与Nur77之间相互作用的模式,为针对p38α的药物设计寻找新靶点。为此,我们设计了Nur77-LBD多肽,利用ITC检测其中两条多肽与p38α存在相互作用,并对其复合物结晶条件进行筛选,初步获得疑似复合物晶体的结晶条件。同时,我们成功表达纯化出状态稳定的15N p38α蛋白,通过p38α与Nur77-LBD的核磁共振化学位移扰动实验,指认出位于p38α上信号发生减弱的五个氨基酸位点,为后续对相互作用位点的确定奠定了基础。除了以上研究,我们还开展了基于p38α晶体结构的药物筛选,确定了两个片...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1. 前言
    1.1 MAPK信号通路概述
        1.1.1 ERK1/2信号通路
        1.1.2 ERK5信号通路
        1.1.3 JNK信号通路
    1.2 p38信号通路
        1.2.1 p38的分类
        1.2.2 p38α结构特点
        1.2.3 p38α的激活机制
        1.2.4 p38α下游底物
        1.2.5 p38α激活的生物学功能
        1.2.6 p38α抑制剂研究进展
    1.3 孤儿核受体Nur77概述
        1.3.1 核受体超家族的分类
        1.3.2 孤儿核受体Nur77的结构特点
        1.3.3 Nur77相关的生理功能
        1.3.4 p38α与Nur77研究进展
    1.4 基于片段化的药物发现
    1.5 本课题研究目的及意义
2. 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 质粒与菌株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
    2.2 实验试剂的配制
        2.2.1 分子克隆相关试剂
        2.2.2 培养基及细菌培养相关试剂
        2.2.3 SDS-PAGE相关试剂
        2.2.4 蛋白表达及纯化相关试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 重组蛋白表达质粒的构建
            2.3.1.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
            2.3.1.2 引物设计
            2.3.1.3 目的基因的PCR扩增与回收
            2.3.1.4 表达质粒双酶切
            2.3.1.5 LIC法构建重组表达质粒
            2.3.1.6 重组质粒的转化
            2.3.1.7 抽提质粒
            2.3.1.8 定点突变
            2.3.1.9 阳性克隆的鉴定
        2.3.2 重组蛋白的表达
            2.3.2.1 重组蛋白的试表达
            2.3.2.2 重组蛋白的大量诱导表达
        2.3.3 重组蛋白的纯化
            2.3.3.1 Ni柱亲和层析
            2.3.3.2 重组蛋白浓缩与脱盐
            2.3.3.3 离子交换层析
            2.3.3.4 凝胶过滤层析
        2.3.4 重组蛋白性质检测
        2.3.5 重组蛋白的结晶
            2.3.5.1 结晶条件的初步筛选
            2.3.5.2 结晶条件的优化
            2.3.5.3 蛋白晶体与小分子的soaking实验
            2.3.5.4 蛋白晶体衍射数据的收集
            2.3.5.5 蛋白晶体的结构解析
        2.3.6 重组蛋白的相互作用分析
            2.3.6.1 等温滴定量热法(ITC)
            2.3.6.2 NMR实验
3. 实验结果与分析
    3.1 p38α蛋白的表达
    3.2 p38α蛋白的纯化
        3.2.1 Ni柱亲和层析纯化
        3.2.2 脱盐
        3.2.3 离子交换层析
        3.2.4 凝胶过滤层析
    3.3 p38α蛋白性质检测
    3.4 p38α与Nur77-LBD多肽相互作用研究
        3.4.1 Nur77-LBD多肽的合成与分析
        3.4.2 p38α与Nur77-LBD多肽相互作用检测
            3.4.2.1 ITC实验
            3.4.2.2 NMR实验
        3.4.3 p38α与Nur77-LBD多肽共结晶条件筛选
        3.4.4 p38α与Nur77-LBD多肽复合物结晶条件优化
        3.4.5 讨论与总结
    3.5 p38α的药物筛选
        3.5.1 p38α蛋白的结晶
        3.5.2 p38α与片段小分子复合物的获得
        3.5.3 衍射数据的收集及结构解析
        3.5.4 讨论与总结
    3.6 展望
参考文献
致谢



本文编号：3756473