载盐霉素的聚乙二醇—神经酰胺胶束的抗肝癌作用研究

发布时间：2017-05-18 13:15

  本文关键词：载盐霉素的聚乙二醇—神经酰胺胶束的抗肝癌作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本课题成功设计了载盐霉素的聚乙二醇-神经酰胺胶束(SCM),它将具有治疗作用的盐霉素(SAL)包载于载体聚乙二醇-神经酰胺(PEG-CRM)形成的胶束内,以同时杀伤肝癌细胞和肝癌干细胞。由于可提高SAL的水溶性和载体对普通肝癌细胞的杀伤能力的增强作用,加之胶束的渗透性使得更多的SAL靶向到肿瘤部位,为肝癌的治疗提供新的策略。首先,利用高效液相色谱法和液质联用法建立盐霉素的体内外检测方法学,并考察方法学的专属性、线性、精密度和准确度等,为SAL的体内外测定提供基础。结果显示,该方法测定SAL具有特异性,且在7.8~1000μg/mL的浓度范围内,SAL的浓度(C)与峰面积(A)呈良好的线性关系,其线性回归方程为A=1012.4C+7115.6(R2=0.9999)。本课题所建立的高效液相色谱法所测得的SAL的精密度和准确度变动范围均在3%之内,表明该方法学可用于测定SAL的浓度,符合实验的要求。以非诺贝特(FNBT)为内标建立测定体内SAL的LC-MS检测方法,线性范围为20~1000ng/m L时,线性回归方程为A=0.005995C-0.01851,R2=0.999,定量下限为20ng/mL。当S/N≥3时,SAL的最低检测限为4 ng/mL,可满足实验的要求。其次,主要考察盐霉素和聚乙二醇-神经酰胺对肿瘤细胞和肿瘤干细胞的杀伤毒性。我们选取的是肝癌HepG2细胞系以及通过悬浮状态培养形成的HepG2微球体。大量培养HepG2细胞并考察SAL和PEG-ceramide两种药物在HepG2细胞系的相互作用,即将两种游离药物分别以1:2,1:3,1:4三种摩尔比例混合,对HepG2肝癌细胞进行杀伤,筛选得到游离SAL和PEG-ceramide两者联用比例为1:4或1:2(mol/mol)时,对HepG2细胞杀伤效果较好。随后制备两种药载比的聚乙二醇-神经酰胺胶束,对HepG2细胞及其微球体进行杀伤,发现两种药载比胶束的杀伤效果无显著性差异,但是考虑到盐霉素的毒性,最终确定1:4为SAL和PEG-ceramide两药联合作用的最佳协同比例。第三,利用薄膜分散法制备上述优化比例的载盐霉素的聚乙二醇-神经酰胺胶束,并对其理化性质,包括粒径、Zeta电位、临界胶束浓度(CMC)、包封率、载药量及体外释放度进行考察,发现所制备的载药胶束粒径为11.02±2.34nm,Zeta电位为-5.66±0.77mV,临界胶束浓度值为7.94μg/mL,包封率和载药量分别为76.74±4.05%和6.32±0.57%,在中性条件下48h累计释放率为65%,表现出一定的缓释特性。用透射电镜观察其形态,发现其大小均一,分散均匀且无粘连。第四,我们将上述制备的优化比例的载药胶束(SCM)进行了体外细胞学考察,包括采用CCK-8(Cell Counting Kit-8,细胞计数试剂盒)法测定胶束对HepG2细胞及其微球体的毒性,Annexin V-FITC/PI双染法考察肝癌Hep G2细胞和微球体的凋亡,克隆形成实验、微球体形成率实验测定HepG2细胞及其微球体给药后各组肝癌细胞的增殖能力以及利用激光共聚焦仪器考察肝癌HepG2细胞、HepG2-TS及HepG2-TS单细胞悬液对载荧光物质的聚乙二醇-神经酰胺胶束的摄取能力。结果表明,将SAL以1:4的药载比包裹于PEG-ceramide胶束中较游离SAL对HepG2细胞以及微球体的细胞杀伤作用更强,诱导细胞凋亡及抑制细胞增殖的能力更强,而且,由实验结果可知,HepG2细胞及HepG2-TS对载荧光物质PECF的PEG-ceramide胶束的摄取能力更强,进一步表明聚乙二醇-神经酰胺胶束具有较强的靶向肝癌细胞和肝癌干细胞的能力。最后,我们对新制备的载药胶束进行了体内动物实验的考察。首先考察胶束载体对BALB/C小鼠的安全性,即小鼠尾静脉给药后,对小鼠心、肝、脾、肺、肾做CD68免疫组化和HE染色,并对小鼠血液进行血常规分析,结果表明胶束载体仅对小鼠肝和肾产生轻微的毒性,且具有一过性,具备用药安全特性。其次,制备包载荧光探针Dir的PEG-ceramide胶束,通过建立HepG2荷瘤裸鼠模型,评价荧光胶束在动物体内的分布和肿瘤靶向性,结果表明载Dir荧光物质的胶束主要分布在肝和肿瘤中,且在肿瘤部位有更多的蓄积,具有很强的肿瘤靶向和肿瘤渗透性。随后制备肿瘤冰冻切片以期探讨载PECF荧光染料胶束的靶向性,结果显示载PECF的荧光胶束在肿瘤部位的荧光强度最大,靶向性最好。接着利用LC-MS分析载药胶束在SD大鼠体内有关盐霉素的药动学特征,结果显示载药聚乙二醇-神经酰胺胶束(SCM)和载药DSPE-PEG胶束(SDM)均可延缓SAL在血浆中的消除,而且SCM效果更显著。最后从离体肿瘤的大小、离体肿瘤的重量、肿瘤体积生长曲线以及裸鼠体重变化四个方面考察各组药物处方的体内抗肿瘤活性与系统毒性,结果显示SCM胶束组无明显的系统毒性,且抗肿瘤活性效果更佳。综上所述,本课题所制备的载盐霉素的聚乙二醇-神经酰胺胶束能够有效的杀伤肝癌细胞和肝癌干细胞,具有较好的体内的抗肿瘤活性,在肝癌治疗方面表现出良好的应用前景。
【关键词】：聚乙二醇-神经酰胺胶束 盐霉素 肝癌细胞 肝癌干细胞
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 缩略词表12-13
• 前言13-16
• 第一章 SAL体外含量测定方法的建立16-21
• 一、仪器与试剂16-17
• （一）仪器16
• （二）材料与试剂16-17
• 二、实验方法与结果17-20
• （一）SAL含量测定方法的建立17-18
• （二）SAL含量测定方法的结果18-20
• 三、小结20-21
• 第二章 SAL和PEG-ceramide的细胞毒性实验21-29
• 一、仪器与试剂21-22
• （一）仪器21
• （二）试剂21-22
• （三）细胞22
• 二、实验方法与结果22-28
• （一）肝癌Hep G2细胞及HepG2微球体的培养22-24
• （二）细胞毒性及结果24-26
• （三）协同比例的确定及结果26-28
• 三、小结28-29
• 第三章 纳米胶束的制备及表征29-35
• 一、仪器与试剂29-30
• （一）仪器29
• （二）试剂29-30
• 二、实验方法与结果30-34
• （一）纳米胶束的制备30
• （二）纳米胶束的处方优化30-31
• （三）纳米胶束的表征31-34
• 三、小结34-35
• 第四章 体外抗肝癌细胞和肝癌干细胞的活性研究35-47
• 一、仪器与材料35-36
• （一）仪器35
• （二）材料35-36
• （三）细胞36
• 二、实验方法与结果36-46
• （一）细胞毒性实验36-39
• （二）细胞凋亡实验39-42
• （三）克隆形成实验42-44
• （四）微球体形成率实验44
• （五）细胞摄取实验44-46
• 三、小结46-47
• 第五章 纳米胶束的体内抗肝癌活性研究47-63
• 一、仪器与试剂47-48
• （一）仪器47
• （二）材料47-48
• （三）动物48
• 二、实验方法与结果48-61
• （一）胶束体内安全性评价48-51
• （二）胶束体内靶向性评价51-54
• （四）胶束体内药代动力学54-58
• （五）胶束体内药效学研究58-61
• 三、小结61-63
• 全文总结63-65
• 参考文献65-71
• 肿瘤治疗新策略：联合药物疗法同时杀伤肿瘤细胞和肿瘤干细胞（综述）71-83
• 参考文献77-83
• 硕士期间发表论文及参加科研工作情况83-84
• 致谢84

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本文编号：376169