基于片段的BRD4抑制剂设计的研究

发布时间：2023-05-11 03:36

　　Bromodomain(BRDs)是一种约含110个氨基酸的溴蛋白质功能结构域,能够特异性识别乙酰化赖氨酸的保守蛋白结构域,参与组蛋白乙酰化信号的传递,进而调控基因转录,人类许多疾病的发生都与BET蛋白有着密切的关系。其中溴结构域识别蛋白4(BRD4)通过正性转录延伸因子调控转录延长,是转录延伸的关键介质;结合转录起始位点影响有丝分裂,其表达失调与多种癌症相关。针对此蛋白的靶向药物,与乙酰赖氨酸识别序列竞争结合,可诱发肿瘤细胞的凋亡和增殖减缓以达到抗癌的目的。所以,研究BRD4蛋白质的抑制剂成为近年来生物化学领域的一大热点。但目前只有少量相关抑制剂被报道,且结构类型也比较单一。基于片段的药物设计(FBDD)是一种将随机筛选和基于结构的药物设计结合的药物发现新方法。基于片段的药物设计已在多个实验室中应用,并已产生进入临床试验的药物。生物膜干涉技术(BLI)是全球增长最快的非标记(label-free)检测技术,可实时监控整个分子间的结合过程,并计算出分子之间的亲和力(KD)、结合速率(ka)、解离速率(kd)等重要数据,可提供实时的、非标记的分子间相互作用及含量检测信息。本研究利用“基于...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
绪论
    参考文献
第一部分 实验材料与仪器
    1. 实验菌株及质粒
    2. 生化试剂及耗材
    3. 工具酶及试剂盒
    4. 实验仪器设备
    5. 实验室常用溶液及配制方法
        5.1 感受态细胞制备所需溶液
        5.2 BRD4蛋白表达所需溶液
        5.3 BRD4蛋白纯化缓冲液
        5.4 SDS-PAGE电泳缓冲液
        5.5 蛋白质结晶溶液及优化条件
第二部分 实验方法
    1. 基因克隆
        1.1 确定原核表达系统及使用菌株和质粒
        1.2 蛋白质标签的选择
        1.3 去除蛋白标签
        1.4 构建重组表达载体
        1.5 BL21(DE3)感受态细胞制备
        1.6 质粒转化
        1.7 菌落PCR
        1.8 质粒提取与测序
    2. 蛋白质的表达与纯化
        2.1 蛋白质的表达
        2.2 细胞裂解
        2.3 蛋白质亲和层析纯化
        2.4 蛋白质酶切
        2.5 蛋白质凝胶层析纯化
    3. 蛋白质的检测
        3.1 蛋白质浓度检测
        3.2 SDS-PAGE电泳
    4. BRD4活性的测定
    5. 生物膜干涉技术筛选药物小分子
    6. 蛋白质结晶、与药物小分子共晶
        6.1 蛋白质晶体的培养
        6.2 蛋白质结晶溶液筛选
        6.3 结晶条件优化
        6.4 蛋白质与小分子共结晶
    7. 数据收集和处理
    8. 基于片段的药物分子设计
        8.1 基于片段的药物设计原理
        8.2 活性片段的检测技术
        8.3 从片段到先导化合物
    9. 蛋白质与改造后的药物小分子共晶
    参考文献
第三部分 实验结果与分析
    1. BRD4基因克隆序列分析及结果
        1.1 BRD4蛋白序列及密码子优化DNA序列
        1.2 设计DNA序列
        1.3 合成质粒的酶切验证结果
        1.4 转化后菌落PCR验证结果
        1.5 BRD4测序结果
    2. BRD4的表达纯化
        2.1 镍亲和层析纯化结果
        2.2 凝胶柱层析纯化结果
    3. 蛋白质活性检测
    4. 生物膜干涉技术筛选药物小分子
    5. 蛋白质结晶与共晶
        5.1 药物小分子68/PBN2011592-1对于BRD4蛋白质结晶的作用
        5.2 蛋白质晶体
        5.3 衍射数据解析结果
    6. 基于片段的药物分子设计
        6.1 优化后的小分子
        6.2 优化后的小分子与蛋白质结晶
        6.3 衍射数据结果
总结与展望
参考文献
文献综述 基于片段的药物设计研究进展
    参考文献
符号及缩略词表
附录
攻读硕士学位期间取得的学术成果
致谢



本文编号：3814078