可解离的人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白的初步研究

发布时间：2017-05-21 13:02

  本文关键词：可解离的人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：胰高血糖素样肽-1是在肠L细胞中分泌的一种由30个氨基酸残基组成的功能短肽。它具有葡萄糖依赖性的促进胰岛素分泌、减慢胃的排空、减少食物摄取、以及抑制胰高血糖素的分泌、刺激胰岛B细胞的增殖和抑制其凋亡等多种功能。GLP-1通过与胰岛B细胞上的GLP-1受体相结合,使后者以葡萄糖依赖的方式分泌胰岛素。II型糖尿病人常常表现为GLP-1分泌受损,而人体胰岛B细胞对GLP-1的反应往往是正常的,因此GLP-1在治疗II型糖尿病方面具有良好的应用前景。但是,机体本身产生的有活性的GLP-1很容易被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)降解而失去活性,同时很容易从肾脏排出体外,故其生物半衰期仅为2-6min,这在很大程度上限制了其临床应用与疗效。小分子蛋白类药物的长效化改造通常是将其与具有较长半衰期的人血清白蛋白或聚乙二醇相结合。然而由于HSA的空间位阻效应,传统的人血清白蛋白融合技术在改善药代动力学性质的同时往往伴随着药效动力学)性质的下降。本项研究中通过在GLP-1和HSA之间插入能够被弗林蛋白酶(furin)切割的多肽序列,使得GLP-1在体内以可控和靶向的方式被释放,同时将其序列中的第二位Ala替换为Gly,阻止DPP-IV的降解,恢复其生物学活性,从而在药代动力学和药效动力学性质之间达到平衡,使其发挥最大疗效。本研究的目标在于构建四种在体内以不同速率解离的人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)与人血清白蛋白融合蛋白,进一步考察各种融合蛋白的疗效与其解离速率之间的关系,获得在药代动力学和药效动力学之间保持最佳平衡的融合蛋白。所用到的方法及结论主要有：1、通过多步PCR扩增出具有不同解离速率的融合蛋白的全部基因,将其克隆到表达载体pPIC9,电转化至毕赤酵母GS115,经过甲醇诱导,分泌表达各种GLP-1与HSA融合蛋白,并将各种融合蛋白分离纯化后进行初步药代学和药效学研究。2、通过将各种融合蛋白样品与furin共同孵育后,其酶切产物用Western印迹法进行检测。结果表明,不可解离的融合蛋白在furin的作用下未发生解离,而可解离的融合蛋白Gly2-GLP-1-VTR-HSA为慢解离,Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA为中等速率解离,Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA为快解离。3、通过在不同浓度的葡萄糖环境下,用各种融合蛋白刺激MIN6细胞分泌胰岛素,检测分泌量的变化方法来确定各融合蛋白的体外生物学活性。结果表明,在高糖(25mM)和低糖(0.5mM)环境下,Gly2-GLP-1-GGGGG-HSA,Gly2-GLP-1-VTR-HSA,Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA和Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA组胰岛素释放量均高于空白对照组,差异极显著；而融合蛋白之间的胰岛素释放量无显著性差异。4、通过皮下注射100μg的各种融合蛋白,于不同时间点通过尾静脉取血,利用双抗体夹心法Elisa进行检测血清中融合蛋白的浓度来确定各种融合蛋白的药代动力学性质。结果表明各种融合蛋白在体内的半衰期大小依次为Gly2-GLP-1-GGGGG-HSA、Gly2-GLP-1-VTR-HSA、Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA、Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA。5、将实验小鼠腹腔单独注射葡萄糖后,立即皮下注射生理盐水和不同融合蛋白的(40nmol/kg)供试样品。于不同时间点取血,测定血糖浓度来评价各种融合蛋白的体内药效动力学性质,结果表明各种融合蛋白均表现出降糖活性,且其活性高低依次为Gly2-GLP-1-VTR-HSA、Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA、Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA、Gly2-GLP-1-GGGGG-HSA。本研究中引入蛋白酶切割位点后,GLP-1可以在体内从融合蛋白中解离出来,使其恢复生物学活性。只有控制融合蛋白在体内适当的解离速率才能达到最佳的疗效,从而在药代动力学和药效动力学性质之间达到平衡。本项研究利用可解离的人血清白蛋白融合技术将为长效蛋白药物开发中面临的药效动力学和药代动力学之间的矛盾提供一种有效的解决途径。同时,本项研究中构建的GLP-1与HSA的融合蛋白还将为创新药物的研发提供坚实的实验基础。
【关键词】：胰高血糖素样肽-1 人血清白蛋白 药效动力学 药代动力学
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 符号说明11-12
• 第一章 前言12-24
• 1 糖尿病的概述12-14
• 1.1 糖尿病的分类12-13
• 1.2 糖尿病的发病机制13
• 1.3 糖尿病的治疗策略13-14
• 2 GLP-1简介14-20
• 2.1 GLP-1的合成、分泌和降解14-15
• 2.2 GLP-1的生物学作用15-17
• 2.3 GLP-1类药物的研究进展17-20
• 3 可解离的人血清白蛋白融合技术20-22
• 3.1 人血清白蛋白技术20-21
• 3.2 可解离的人血清白蛋白融合技术21-22
• 4 研究意义22
• 5 研究内容22-24
• 第二章 人胰高血糖素样肽-1和人血清白蛋白融合蛋白载体的构建与表达24-56
• 1 实验材料24-28
• 1.1 菌种及质粒24-25
• 1.2 主要生化和分子生物学试剂25
• 1.3 主要培养基及缓冲液配制25-27
• 1.4 主要仪器27-28
• 2 实验方法28-49
• 2.1 各种人胰高血糖素样肽-1和人血清白蛋白融合蛋白基因的克隆28-36
• 2.2 基因片段连接pEASY-Blunt载体36-38
• 2.3 各种人胰高血糖素样肽-1和人血清白蛋白融合蛋白表达载体的构建38-44
• 2.4 各种表达载体电转化毕赤酵母菌株以及目的基因的诱导表达44-47
• 2.5 各种毕赤酵母重组菌的摇瓶培养47
• 2.6 目的蛋白的分离纯化47-48
• 2.7 Lorry法测定蛋白浓度48-49
• 3 实验结果49-53
• 3.1 各种融合蛋白基因的克隆49
• 3.2 各种融合蛋白表达载体的构建与鉴定49-50
• 3.3 转化子的菌液PCR鉴定50-51
• 3.4 各种融合蛋白的诱导表达51-52
• 3.5 融合的蛋白的分离纯化52-53
• 4 讨论53-56
• 第三章 融合蛋白的体外评价56-64
• 1 实验材料57-58
• 1.1 细胞株57
• 1.2 主要试剂57
• 1.3 实验仪器57-58
• 2 实验方法58-59
• 2.1 融合蛋白的体外解离实验58
• 2.2 细胞培养58
• 2.3 融合蛋白体外生物学活性的测定58-59
• 2.4 胰岛素含量的测定59
• 3 实验结果59-62
• 3.1 融合蛋白体外解离实验59-61
• 3.2 融合蛋白体外生物学活性的测定61-62
• 4 讨论62-64
• 第四章 融合蛋白的体内评价64-70
• 1 实验材料64-65
• 1.1 实验动物64
• 1.2 主要试剂64
• 1.3 主要仪器64-65
• 2 实验方法65-66
• 2.1 血浆药物浓度—时间曲线的测定65-66
• 2.2 口服葡萄糖耐受实验(OGTT)66
• 2.3 长效降糖活性的检测66
• 3 实验结果66-68
• 3.1 血浆药物浓度—时间曲线的测定66-67
• 3.2 口服葡萄糖耐受实验67-68
• 3.3 长效降糖活性的检测68
• 4 讨论68-70
• 第五章 结论与展望70-72
• 1 主要结论70
• 2 存在的问题及展望70-72
• 参考文献72-80
• 致谢80-82
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文、专利及参加的会议82

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