3C蛋白在EV71诱导的细胞凋亡中的作用机制及Caspase-3抑制剂的保护作用
发布时间：2024-04-15 03:50
手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)通常表现为5岁以下儿童常见的发热性发疹性疾病,症状包括:手掌和足底,颊粘膜,舌头和臀部的囊泡,其主要传播病原体是人肠道病毒(Enterovirus71,EV71)。研究表明宿主细胞凋亡与病毒复制之间关系复杂,而已知EV71病毒颗粒感染宿主细胞后诱导凋亡的发生,因此阐明凋亡在EV71病毒复制过程中的作用机制对我们应用凋亡相关药物抗手足口病至关重要。半胱天冬氨酸水解酶(Caspases-3)是参与细胞凋亡的重要因子,而凋亡影响病毒复制主要是通过影响病毒的非结构蛋白实现的。病毒非结构蛋白3C不仅在病毒蛋白的成熟过程中扮演关键角色,研究还表明,EV71通过非结构性病毒蛋白3C激活Caspase-3以诱导宿主细胞凋亡,然而,直到现在还不清楚3C如何激活Caspases以及Caspase激活到底是如何影响病毒的产生的。首先,我们探究了3C和Caspase蛋白激活之间的关系,研究对象为人肝癌细胞Hep G2,通过细胞形态学、核染色研究Hep G2转染3C后引起的细胞病变效应以及Caspase-3抑制剂对Hep G2转染3C保...
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
前言
中文摘要
Abstarct
缩略词表
第1章 绪论
1.1 研究背景
1.2 EV71病毒结构特点和非结构蛋白 3C研究进展
1.3 CASPASE激活调控宿主细胞凋亡的机制探究
1.3.1 EV71感染宿主细胞的凋亡研究状况
1.3.2 宿主细胞凋亡与病毒复制的关系
1.4 抗EV71药物研究进展
第2章 材料和方法
2.1 实验材料，仪器和试剂
2.1.1 病毒和细胞
2.1.2 质粒和突变体的构建
2.1.3 主要仪器
2.1.4 抗体
2.1.5 主要试剂
2.2 实验方法
2.2.1 细胞复苏、培养及传代
2.2.2 病毒扩增
2.2.3 实验分组
2.2.4 使用Caspase抑制剂时处理过程
2.2.5 细胞形态学及核染色
2.2.6 lipo2000转染法细胞转染实验
2.2.7 凝胶电泳和免疫印迹
2.2.8 半胱天冬酶活性测定
2.2.9 免疫共沉淀
2.2.10 琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段化
2.2.11 MTT法测定细胞增殖率
2.2.12 使用血细胞计数器进行细胞计数
2.2.13 IL-6分泌的酶联免疫吸附测定（ELISA）
2.2.14 通过流式细胞法进行细胞周期分析
2.2.15 5'UTR质粒构建和萤光素酶测定
2.2.16 定量实时RT PCR
2.2.17 蔗糖垫超速离心法收获病毒
2.2.18 病毒滴度测定
2.2.19 统计分析
第3章 结果与分析
3.1 3C能够引起细胞凋亡，结合并激活CASPASE-8、9 进而激活CASPASE-3
3.1.1 EV71感染和非结构蛋白 3C引起细胞的病变效应
3.1.2 EV71的非结构 3C蛋白酶结合Caspase-8 和Caspase-9 并介导caspase-3 的激活
3.2 CASPASE-3 抑制剂抑制 3C转染HEPG2细胞中的CASPASE-3 活化和并阻止细胞病变
3.2.1 Caspase-3 抑制剂抑制 3C转染的细胞中的Caspase-3 活化
3.2.2 Caspase-3 抑制剂抑制 3C转染的细胞病变效应
3.3 CASPASE-3 抑制剂保护RD细胞免于EV71感染诱导的细胞病变效应
3.3.1 Caspase-3 抑制剂浓度最佳选择
3.3.2 Caspase-3 抑制剂抑制EV71感染细胞中的Caspase-3 活化
3.3.3 Caspase-3 抑制剂避免EV71感染RD细胞病变效应的出现
3.3.4 Caspase-3 抑制剂抑制RD细胞炎症因子释放
3.3.5 Caspase-3 抑制剂反转EV71感染RD细胞引起的S期阻滞
3.4 CASPASE-3 抑制剂抑制EV71感染性
3.4.1 Caspase-3 抑制剂对病毒侵入和复制的影响
3.4.2 Caspase-3 抑制剂对病毒蛋白VP1表达和病毒毒力的影响
第4章 讨论
4.1 CASPASE-3，8，9 与 3C之间的相互作用关系
4.2 CASPASE-3 抑制剂通过抑制 3C活化CASPASE-3 阻止细胞病变
4.3 CASPASE-3 抑制剂阻止宿主细胞的凋亡的发生
4.4 CASPASE-3 抑制剂对EV71病毒感染性和毒力的影响
第5章 结论与创新点
参考文献
作者简介及硕士期间取得的成果
致谢
本文编号：3955687
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
前言
中文摘要
Abstarct
缩略词表
第1章 绪论
1.1 研究背景
1.2 EV71病毒结构特点和非结构蛋白 3C研究进展
1.3 CASPASE激活调控宿主细胞凋亡的机制探究
1.3.1 EV71感染宿主细胞的凋亡研究状况
1.3.2 宿主细胞凋亡与病毒复制的关系
1.4 抗EV71药物研究进展
第2章 材料和方法
2.1 实验材料，仪器和试剂
2.1.1 病毒和细胞
2.1.2 质粒和突变体的构建
2.1.3 主要仪器
2.1.4 抗体
2.1.5 主要试剂
2.2 实验方法
2.2.1 细胞复苏、培养及传代
2.2.2 病毒扩增
2.2.3 实验分组
2.2.4 使用Caspase抑制剂时处理过程
2.2.5 细胞形态学及核染色
2.2.6 lipo2000转染法细胞转染实验
2.2.7 凝胶电泳和免疫印迹
2.2.8 半胱天冬酶活性测定
2.2.9 免疫共沉淀
2.2.10 琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段化
2.2.11 MTT法测定细胞增殖率
2.2.12 使用血细胞计数器进行细胞计数
2.2.13 IL-6分泌的酶联免疫吸附测定（ELISA）
2.2.14 通过流式细胞法进行细胞周期分析
2.2.15 5'UTR质粒构建和萤光素酶测定
2.2.16 定量实时RT PCR
2.2.17 蔗糖垫超速离心法收获病毒
2.2.18 病毒滴度测定
2.2.19 统计分析
第3章 结果与分析
3.1 3C能够引起细胞凋亡，结合并激活CASPASE-8、9 进而激活CASPASE-3
3.1.1 EV71感染和非结构蛋白 3C引起细胞的病变效应
3.1.2 EV71的非结构 3C蛋白酶结合Caspase-8 和Caspase-9 并介导caspase-3 的激活
3.2 CASPASE-3 抑制剂抑制 3C转染HEPG2细胞中的CASPASE-3 活化和并阻止细胞病变
3.2.1 Caspase-3 抑制剂抑制 3C转染的细胞中的Caspase-3 活化
3.2.2 Caspase-3 抑制剂抑制 3C转染的细胞病变效应
3.3 CASPASE-3 抑制剂保护RD细胞免于EV71感染诱导的细胞病变效应
3.3.1 Caspase-3 抑制剂浓度最佳选择
3.3.2 Caspase-3 抑制剂抑制EV71感染细胞中的Caspase-3 活化
3.3.3 Caspase-3 抑制剂避免EV71感染RD细胞病变效应的出现
3.3.4 Caspase-3 抑制剂抑制RD细胞炎症因子释放
3.3.5 Caspase-3 抑制剂反转EV71感染RD细胞引起的S期阻滞
3.4 CASPASE-3 抑制剂抑制EV71感染性
3.4.1 Caspase-3 抑制剂对病毒侵入和复制的影响
3.4.2 Caspase-3 抑制剂对病毒蛋白VP1表达和病毒毒力的影响
第4章 讨论
4.1 CASPASE-3，8，9 与 3C之间的相互作用关系
4.2 CASPASE-3 抑制剂通过抑制 3C活化CASPASE-3 阻止细胞病变
4.3 CASPASE-3 抑制剂阻止宿主细胞的凋亡的发生
4.4 CASPASE-3 抑制剂对EV71病毒感染性和毒力的影响
第5章 结论与创新点
参考文献
作者简介及硕士期间取得的成果
致谢
本文编号：3955687
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