新型NEK2抑制剂MBM-5抗肿瘤作用及其机制研究

发布时间：2017-05-30 21:16

  本文关键词：新型NEK2抑制剂MBM-5抗肿瘤作用及其机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：NEK2是细胞周期调控蛋白相关的丝/苏氨酸激酶家族中的一员,在细胞有丝分裂进程中发挥重要作用。其活性异常会导致染色体不稳定,中心体分离异常及多级纺锤体的形成。NEK2在许多恶性肿瘤细胞中高表达,与肿瘤的发生和恶化密切相关。同时,NEK2表达异常不仅导致染色体不稳定性增加,肿瘤细胞恶性增殖,而且促进细胞产生耐药。NEK2与癌症患者预后不良也存在一定联系。因此,以NEK2为靶点的抑制剂有望成为治疗肿瘤的新型分子靶向药物。目前针对NEK2靶标研发的小分子抑制剂普遍存在选择性差、细胞活性不强、体内抗肿瘤效果弱等问题。开发高活性和选择性的NEK2抑制剂对于基础研究和新药研发均具有重要的意义。据文献报道,改变NEK2激酶上的ATP结合位点,阻断ATP与NEK2的结合可用于NEK2抑制剂的研究。本课题组通过改变NEK2与ATP结合位点设计合成了一系列对NEK2激酶具有潜在抑制活性的化合物。本研究旨在分子、细胞和整体动物水平对这一系列化合物的抗肿瘤活性进行评价,并对其作用机制进行研究。在课题研究中,我们首先采用EZ Reader (Caliper Life Science,LabChip(?) Systems)系列药物筛选平台对29个候选化合物进行NEK2激酶活性抑制作用检测。发现在29个化合物中,有10个化合物对NEK2激酶具有较好的抑制作用,IC50值均小于10μM。且这些化合物中4-NK-005即MBM-5对NEK2激酶的抑制效果最好,IC50= 0.494μnM。同时用HTRF(?) KinEASETM-STK (Cisbio Assays)试剂盒验证了这一结果。之后,我们用MTT法在人胃癌细胞株MGC-803上筛选系列化合物,发现其中有20个化合物具有非常好的抑制肿瘤细胞增殖的作用,它们的IC50值均在2μM以下,有的甚至低于1μM。结合之前的体外激酶活性抑制实验结果,我们最终挑选出化合物MBM-5作为研究对象,并对其做进一步的研究。体外细胞生长抑制实验的研究发现,MBM-5对多种类型的肿瘤细胞的增殖抑制作用也较为显著,尤其是在胃癌和结肠癌细胞株中,大部分IC50值小于1μM,且MBM-5对NEK2高表达细胞株的增值抑制作用更为明显。因此后续实验选用人胃癌细胞株MGC-803和人结肠癌细胞株HCT-116进行实验。体内异种移植瘤模型实验治疗中,MBM-5对人结肠癌HCT-116和人胃癌MGC-803肿瘤生长有一定抑制作用。在HCT-116模型,20mg/kg剂量腹腔注射的TGI为51.10%,而在MGC-803模型,30 mg/kg剂量组TGI为42.35%。SD大鼠的药代实验表明,MBM5在体内代谢较快,t1/2非常短,这是其体内活性较不理想的主要原因。因此,需要进一步优化MBM-5,降低其体内代谢速率,从而提高其抗肿瘤效果。接着我们对MBM-5的分子作用机制进行了研究。首先采用PI染色结合流式细胞术分析MBM-5对肿瘤细胞周期分布的影响,结果表明经MBM-5处理24h后,MGC-803和HCT-116细胞均被阻滞在G2/M期,高浓度MBM-5作用后G2/M期细胞比例均超过60%,并伴有多倍体细胞产生。且随着MBM-5作用时间或作用浓度增加,周期阻滞效果越明显。通过荧光显微镜我们也观察到MGC-803经MBM-5作用12h后,形成多核细胞,多核细胞数占总细胞数的13.79%,而对照组仅0.33%。同时,MGC-803细胞上还出现了染色体排布紊乱的现象,出现这一现象的细胞占总细胞数的7.09%,而对照组仅0.79%。经MBM-5处理后的MGC-803细胞,其核形态发生明显变化,呈棉絮状,在同一个细胞中出现双个甚至多个细胞核。MBM-5作用时间越长,核形态发生改变的细胞数越多。这与周期阻滞实验结果一致,再次证明MBM-5能有效阻滞肿瘤细胞周期进程,形成多核细胞。上述结果表明MBM-5通过抑制NEK2激酶,能明显干扰细胞有丝分裂进程,阻滞肿瘤细胞于G2/M期,导致染色体排布紊乱并形成多核细胞。接下来我们采用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测MBM-5诱导肿瘤细胞凋亡的作用。实验结果表明,在MGC-803上MBM-5 2uM用药24h后凋亡细胞由对照组的8.57%增加到72.84%,在HCT-116细胞上MBM-5 2uM用药24h后细胞凋亡率从7.60%增加到45.43%。且随着MBM-5作用时间或作用浓度增加,诱导细胞凋亡效果越明显。Western Boltting结果也表明,在这两株肿瘤细胞上,经MBM-5处理后凋亡相关蛋白c-Caspase3和PARP-1表达发生变化,随着MBM-5作用时间及作用浓度增加,c-Capase3和c-PARP-1逐渐增多。上述实验证明新型NEK2抑制剂MBM-5具有诱导细胞凋亡的作用。最后我们采用Western Blotting法检测NEK2及其相关蛋白表达水平是变化。研究发现在MGC-803上随着MBM-5作用浓度和作用时间的增加,NEK2及其相关蛋白Hec1表达水平减少,而与细胞周期相关的激酶Aurora A、Aurora B以及它们的磷酸化蛋白表达水平均未发生改变,这表明MBM-5阻止细胞周期进程是通过抑制NEK2激酶及其相关蛋白Hec1表达造成,与其他周期激酶如Aurora A、Aurora B等无关。接着,我们研究了MBM-5处理后肿瘤细胞上NEK2及其相关蛋白的降解通路。研究发现,在MGC-803细胞上,MBM-5作用过程中加入MG-132(蛋白酶体抑制剂)后,NEK2蛋白逐渐累积恢复到与对照相同。相反,泛素-蛋白酶体途径未受抑制的情况下,经MBM-5处理后的细胞NEK2蛋白表达减少。NEK2的下游蛋白Hec-1降解方式与NEK2基本一致。但是AuroraA和Aurora B的表达水平未受影响。上述研究表明,MBM-5能促进泛素-蛋白酶体通路对NEK2及其相关蛋白Hec1的降解。因此,以改变NEK2的ATP结合位点,阻断NEK2与ATP结合为目的设计的NEK2抑制剂MBM-5,具有良好的周期阻滞和诱导细胞凋亡的作用,能够有效并专一地抑制NEK2激酶,表现出较为显著的体内外抗肿瘤活性。本研究为此类药物的设计合成提供了实验依据,为NEK2抑制剂的研发提供了新的思路。
【关键词】：NEK2激酶 MBM5 细胞周期 细胞凋亡 抗肿瘤作用
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 内容摘要6-9
• Abstract9-16
• 第一章 前言16-26
• 1. NEK2激酶及其功能16-19
• 1.1 NEK激酶家族16-17
• 1.2 NEK2激酶的结构17-18
• 1.3 NEK2激酶的功能18-19
• 2. NEK2激酶与癌症的关系19-23
• 2.1 NEK2激酶与肿瘤发生20
• 2.2 NEK2激酶与肿瘤耐药20-22
• 2.3 NEK2激酶与肿瘤预后22-23
• 3. NEK2激酶抑制剂的研究现状23-24
• 4. 研究目的和研究内容24-26
• 第二章 NEK2抑制剂筛选26-36
• 1. 实验材料26-28
• 1.1 化合物及试剂26-27
• 1.2 主要耗材27
• 1.3 化合物27
• 1.4 细胞株及培养条件27-28
• 2. 实验仪器28
• 3. 实验方法28-30
• 3.1 细胞培养28-29
• 3.2 化合物NEK2激酶抑制活性筛选29-30
• 3.2.1 利用EZ Reader药物筛选平台筛选化合物29
• 3.2.2 利用HTRF(?) KinEASE~(TM)-STK(Cisbio Assays)筛选化合物29-30
• 3.3 化合物体外细胞生长抑制活性筛选30
• 4. 实验结果30-34
• 4.1 分子水平MBM系列化合物筛选30-32
• 4.1.1 EZ Reader检测29个候选化合物对NEK2激酶的活性抑制作用30-31
• 4.1.2 HTRF(?) KinEASE~(TM)-STK试剂盒验证MBM-5对NEK2激酶的抑制作用31-32
• 4.2 MBM-5能有效抑制MGC-803肿瘤细胞增殖32-34
• 5. 讨论34-36
• 第三章 新型NEK2抑制剂MBM-5的体内外抗肿瘤活性研究36-62
• 1. 实验材料36-39
• 1.1 化合物及试剂36-37
• 1.2 主要耗材37
• 1.3 化合物37
• 1.4 细胞株及培养条件37-38
• 1.5 实验动物38-39
• 2. 实验仪器39
• 3. 实验方法39-45
• 3.1 体外细胞水平检测实验方法39-43
• 3.1.1 化合物体外细胞生长抑制活性检测39-40
• 3.1.2 免疫印迹40-42
• 3.1.3 统计分析42-43
• 3.2 体内检测实验方法43-45
• 3.2.1 体内药物最大耐受剂量(MTD)检测43
• 3.2.2 小鼠肿瘤细胞皮下接种43
• 3.2.3 小鼠分组43-44
• 3.2.4 小鼠腹腔注射44
• 3.2.5 数据处理44
• 3.2.6 SD大鼠药代的实验方法44-45
• 3.2.7 统计分析45
• 4. 实验结果45-60
• 4.1 新型NEK2抑制剂MBM-5的体外抗肿瘤活性研究45-50
• 4.1.1 小分子化合物MBM-5能抑制多种癌细胞的生长45-47
• 4.1.2 MBM-5对NEK2高表达的细胞株具有较好的增值抑制作用47-48
• 4.1.3 小分子化合物MBM-5抑制肿瘤细胞生长的形态学观察48-50
• 4.2 新型NEK2抑制剂MBM-5的体内药效学评价50-57
• 4.2.1 MBM-5体内药物最大耐受剂量(MTD)检测50-51
• 4.2.2 MBM-5腹腔注射给药能一定程度上抑制裸鼠体内肿瘤生长51-57
• 4.3 MBM-5的药物代谢研究57-60
• 5. 讨论60-62
• 第四章 MBM5抗肿瘤作用的分子机制研究62-91
• 1. 实验材料62-63
• 1.1 化合物及试剂62-63
• 1.2 主要耗材63
• 1.3 化合物63
• 1.4 细胞株及培养条件63
• 2. 实验仪器63
• 3. 实验方法63-68
• 3.1 细胞周期PI检测法63-64
• 3.2 细胞凋亡AnnexinV-FITC检测法64-65
• 3.3 免疫荧光65-66
• 3.4 细胞周期同步化66-67
• 3.5 免疫印迹67
• 3.6 细胞转染67-68
• 3.7 统计分析68
• 4. 实验结果68-87
• 4.1 MBM-5能有效阻滞肿瘤细胞的细胞周期进程68-78
• 4.1.1 MBM-5能将肿瘤细胞阻滞在G2/M期,并伴有多倍体形成68-70
• 4.1.2 细胞同步化后,MBM-5也能有效阻滞细胞在G2/M期70-73
• 4.1.3 MBM-5干扰细胞有丝分裂,使染色体排布紊乱,形成多核细胞73-77
• 4.1.4 MBM-5对肿瘤细胞核形态变化的影响77-78
• 4.2 MBM-5具有诱导细胞凋亡的作用78-81
• 4.2.1 AnnexinV-FITC试剂盒检测MBM-5具有诱导细胞凋亡的作用78-80
• 4.2.2 Western Blot检测凋亡标志蛋白PARP-1及c-Caspase3的表达80-81
• 4.3 MBM-5通过抑制NEK2及其相关蛋白的表达来抑制肿瘤细胞增殖81-84
• 4.4 MBM-5可能通过泛素-蛋白酶体途径降解NEK2及其相关蛋白Hec184-85
• 4.5 可能由于细胞内源性NEK2表达干扰,MBM-5对过表达外源NEK2的细胞株的增值抑制作用与亲本株无异85-87
• 5. 讨论87-91
• 第五章 总结91-93
• 附录93-96
• 攻读硕士学位期间所发表文章及首页96-97
• 附件97-98
• 缩略词98-100
• 参考文献100-103
• 致谢103-104

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