没食子酸衍生物ZXHA-TC对兔骨关节炎软骨退变的体内外作用研究

发布时间：2017-06-09 04:01

  本文关键词：没食子酸衍生物ZXHA-TC对兔骨关节炎软骨退变的体内外作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 探讨没食子酸衍生物ZXHA-TC对OA中软骨退变的作用。方法：利用SYBYL软件设计IL-1p的抑制剂；以没食子酸为母核合成ZXHA-TC并对其结构进行鉴定。采用两步酶消化法对乳兔关节软骨细胞进行分离培养,MTT试验检测ZXHA-TC及GA的毒性,ZXHA-TC及GA分别对软骨细胞干预1h后,加入IL-1β刺激24h,提取RNA检测MMP-1、MMP-13及TIMP-1基因的表达水平,并用免疫组织化学染色观察MMP-1及Timp-1蛋白表达情况。2、4、6天后通过HE染色法、番红O染色法、FDA/PI荧光染色法、免疫组织化学染色法及qRT-PCR法等研究ZXHA-TC对软骨细胞生物学特性的影响。从44只新西兰兔随机抽取8只作为正常对照组(A组),其余36只行双膝关节前交叉韧带离断术,8周后4只经大体检查及病理取材确定成OA模型,随后随机分为：模型组(B组)与受试药物组(C组),每组16只。按设定剂量关节腔内注射给药(正常对照组不做任何处理,模型组注射生理盐水)0.5mL,每周一次。给药4周、8周后,分别处死动物,取股骨内髁软骨标本,进行大体形态学Pelletier评分；固定,脱钙后石蜡包埋并切片,HE、Masson及番红O染色并行Mankin软骨评分,通过qRT-PCR与免疫组织化学染色法检测相关基因及蛋白的表达,并使用免疫蛋白印记探索ZXHA-TC抑制骨关节炎可能的作用机制。结果：根据SYBYL软件计算出IL-1β蛋白的“活性口袋”坐标并得到先导化合物GA；对GA进行结构优化得到ZXHA-TC,其与“活性口袋”形成稳定的复合物,表明其对IL-1β的活性可能具有明显的抑制作用。通过MTT试验,ZXHA-TC在浓度为6.25×10-7μg/mL,6.25×10-6μg/mL及6.25×10-5μg/mL时促进兔关节软骨细胞的增殖,而没食子酸在0.125μg/mL时对细胞的毒性相对较低。经IL-1β诱导,ZXHA-TC在浓度为6.25×10-6μg/mL时,能明显抑制MMP-1及MMP-13的表达,而增加Timp-1的表达。软骨细胞在培养2、4、6天后,FDA/PI荧光染色显示ZXHA-TC能很好地维持软骨细胞活性；番红O染色及DMMB试验显示,GAG的分泌量在ZXHA-TC组时最高；免疫组织化学染色发现Ⅱ型胶原在ZXHA-TC干预下的分泌较空白对照组及GA组多,而Ⅰ型胶原蛋白的表达量则相反；经ZXHA-TC的干预,DNA含量明显高于空白对照组及GA组；而qRT-PCR结果显示ZXHA-TC组的蛋白聚糖、Sox9及Ⅱ型胶原基因的表达高于空白对照组及GA组,而Ⅰ型胶原基因的则相反,X型胶原基因未检测到有表达。对大体观察股骨髁并进行评分,A组得分最低,B组4周及8周平均得分分别为2.63+0.74和3.25±0.71,C组4周及8周平均得分分别为1.38±0.52和2.25+0.89。Mankin组织学评分,A组的得分最低(0.34+0.01),给药4周后,C组(1.37±0.06)得分低于B组(3.54±0.12)；给药8周后,C组(2.15±0.11)得分远低于B组(5.83±0.32),差异有统计学意义(p0.05)。qRT-PCR检测相关基因表达,B组MMPs的表达远远高于A组于C组,而Timp-1的表达在C组最高；p38及NF-κB在B组的表达明显高于C组。另外,ZXHA-TC可能可以阻断骨关节炎MAPK/p38及TLR/NF-κB通路以抑制骨关节炎的进程。结论：经药物虚拟筛选得到IL-1p抑制剂ZXHA-TC,其对体外培养的关节软骨细胞的表型有保护作用,对兔骨关节炎有明显的减缓作用,因此ZXHA-TC有望作为骨关节炎的治疗药物,且具有成本低廉,合成工艺简单的优势。
【关键词】：没食子酸 ZXHA-TC 软骨细胞 SYBYL 骨关节炎
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 个人简历3-8
• 主要英文缩写词语8-9
• 摘要9-12
• ABSTRACT12-16
• 前言16-19
• 参考文献17-19
• 第一部分 基于受体的药物分子设计与没食子酸衍生物ZXHA-TC的合成及结构鉴定19-25
• 1 材料与方法19-21
• 1.1 试验试剂19
• 1.2 主要仪器19-20
• 1.3 方法20-21
• 2 实验结果21-23
• 2.1 分子设计结果21-22
• 2.2 化合物合成及结构鉴定22-23
• 3 讨论23-24
• 4 结论24
• 参考文献24-25
• 第二部分 ZXHA-TC对体外炎症及关节软骨细胞生物学特性的作用25-51
• 1 材料与方法25-35
• 1.1 试验试剂25
• 1.2 主要仪器25-27
• 1.3 方法27-35
• 2 实验结果35-45
• 2.1 MTT法测定ZXHA-TC的细胞毒性35
• 2.2 ZXHA-TC对IL-1 β诱导关节炎的作用35-37
• 2.3 细胞形态学观察37-38
• 2.4 细胞活性检测38-39
• 2.5 qRT-PCR检测基因相对表达量39-41
• 2.6 DNA含量测定41-42
• 2.7 GAG分泌及含量检测42-44
• 2.8 Ⅰ型及Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色44-45
• 3 讨论45-48
• 4 结论48
• 参考文献48-51
• 第三部分 ZXHA-TC对兔骨关节炎的作用51-68
• 1 材料与方法51-57
• 1.1 试验动物51
• 1.2 主要试剂51-52
• 1.3 方法52-57
• 2 实验结果57-64
• 2.1 骨关节炎模型建立57-58
• 2.2 大体标本观察58-59
• 2.3 组织学检查59-61
• 2.4 组织学评分61-62
• 2.5 关节炎特异基因表达62-63
• 2.6 相关信号通路研究63-64
• 3 讨论64-66
• 4 结论66-67
• 参考文献67-68
• 综述 骨关节炎的基础研究进展68-88
• 1 动物模型68-70
• 1.1 非手术法68-69
• 1.2 手术法69-70
• 2 发病机制70-77
• 2.1 信号通路70-72
• 2.2 细胞因子72-77
• 3 一般药物治疗77-79
• 3.1 症状控制药77-78
• 3.2 关节软骨成分补充剂78-79
• 3.3 OA致炎因子拮抗药79
• 4 总结与展望79-80
• 参考文献80-88
• 致谢88-89
• 攻读硕士期间发表的论文89

【参考文献】

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本文编号：434349