新型免疫调节分子VSIG4对Ⅱ型胶原诱发小鼠关节炎症进展的影响

发布时间：2017-06-09 04:05

  本文关键词：新型免疫调节分子VSIG4对Ⅱ型胶原诱发小鼠关节炎症进展的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：以牛Ⅱ型胶原蛋白诱导的VSIG4-/-(基因背景：C57BL/6)及野生型(基因背景：C57BL/6)关节炎模型小鼠为研究对象,探讨新型免疫调节分子VSIG4在类风湿关节炎病理进程中的影响。进一步构建VSIG4-Fc重组慢病毒载体和稳定表达VSIG4-Fc的RAW264.7细胞株,并初步探讨VSIG4-Fc对巨噬细胞活化的影响。方法：首先将VSIG4-/-(基因背景：C57BL/6)小鼠,以牛Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)与完全弗氏佐剂完全乳化制成乳剂后尾根部皮下注射,在第21天以牛Ⅱ型胶原蛋白与不完全弗氏佐剂加强免疫获得CIA模型。与同系正常小鼠比较分析小鼠关节改变,并进行关节炎临床评分。用HE染色法检测小鼠关节组织病理学改变、免疫组织化学染色法检测关节中TNF-α IL-6、IL-1β、IFN-γ以及IL-17等细胞因子的变化,并采用流式细胞术检测脾淋巴细胞以及腹腔巨噬细胞中TNF-α的变化。接下来将VSIG4-/-(基因背景：C57BL/6)及野生型C57BL/6小鼠,以牛Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)与完全弗氏佐剂完全乳化制成乳剂后尾根部皮下注射,在第21天以牛Ⅱ型胶原蛋白与不完全弗氏佐剂加强免疫获得胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis, CIA)模型,定期观察关节改变,并进行关节炎临床评分。HE染色观察小鼠关节组织病理学改变,免疫组织化学染色法检测关节中TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ以及IL-17等细胞因子的变化。进一步将目的基因VSIG4-Fc和PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV慢病毒载体以ECORI和BamHI进行酶切后连接,获得表达VSIG4-Fc的慢病毒载体,与辅助病毒载体以脂质体法共转染于293T细胞,获得病毒北清后将其感染于RAW264.7细胞,构建稳定表达目的基因的细胞株。采用western blot法检测转基因细胞中VSIG4的表达。进一步使用定量PCR法体外分析VSIG4-Fc融合蛋白对骨髓来源巨噬细胞(BM-derived macrophages, BMDM)及其TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ以及IL-17等细胞因子分泌的影响。结果：1.VSIG4-/-小鼠在牛Ⅱ型胶原蛋白免疫后第9天开始出现明显的多关节肿胀。小鼠踝关节病理检测结果显示明显的滑膜增生,炎症细胞浸润以及关节坏死。进一步研究发现来源于VSIG4-/- CIA小鼠与同系正常小鼠相比,虽然脾淋巴CD4+T细胞分泌的TNF-α没有显著性差异(P0.05),但是腹腔巨噬细胞分泌的TNF-α具有显著性差异(P0.05)。此外,VSIG4-/-CIA小鼠关节组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-17等细胞因子的表达明显高于同系正常小鼠(P0.05)。2.VSIG4-/-(基因背景：C57BL/6)及野生型(基因背景：C57BL/6) CIA小鼠均在初次免疫后第8天开始后脚掌出现明显的红肿,并且在初次免疫后第33天开始,VSIG4-/-模型组临床评分明显高于野生型模型组小鼠(P0.05)。小鼠踝关节病理检测结果显示明显的滑膜增生,炎症细胞浸润以及关节坏死,并且VSIG4-/-C1A小鼠关节滑膜中IL-Iβ、IL-17、IL-6和TNF-α等炎症因子的表达明显高于野生型CIA小鼠(P0.05)。3.成功构建表达VSIG4-Fc的慢病毒载体,并获得稳定表达VSIG4-Fc基因的细胞株,鉴定结果显示其稳定高表达VSIG4。体外实验结果显示,VSIG4-Fc融合蛋白可抑制炎症巨噬细胞所分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-17等细胞因子。结论：牛11型胶原蛋白可诱导VSIG44-小鼠的关节炎,其中腹腔巨噬细胞分泌的TNF-α在其发病过程中可能起关键作用。且VSIG4的基因敲除可加剧Ⅱ型胶原蛋白诱导的关节炎症。并且VSIG4-Fc融合蛋白可抑制巨噬细胞所分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-17等炎症因子。此外,稳定表达VISG4-Fc的RAW264.7转基因细胞的成功构建,为VSIG4的功能研究提供了必要的手段。
【关键词】：类风湿关节炎 胶原诱导性关节炎模型 T细胞 共刺激信号 VSIG4 细胞因子
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一部分 牛Ⅱ型胶原蛋白诱导VS/G4~(-/-)小鼠关节炎模型的建立14-23
• 1.1 材料与仪器14-15
• 1.2 实验方法15-18
• 1.3 统计学处理18
• 1.4 实验结果18-23
• 第二部分 VSIG4基因敲除对牛Ⅱ型胶原蛋白诱导性关节炎症的作用23-28
• 2.1 材料与仪器23-24
• 2.2 实验方法24-25
• 2.3 统计学处理25
• 2.4 实验结果25-28
• 第三部分 稳定表达VSIG4-Fc的RAW264.7细胞系的建立及VSIG4-Fc对巨噬细胞活化的影响28-41
• 3.1 材料和仪器28-29
• 3.2 实验方法29-37
• 3.3 统计学处理37
• 3.4 实验结果37-41
• 第四部分 讨论与结论41-46
• 4.1 讨论41-45
• 4.2 结论45-46
• 参考文献46-53
• 致谢53-54
• 文献综述54-65
• 参考文献62-65

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本文编号：434381