阿司匹林对TNF-α诱导RAW264.7细胞中MMP-9表达的影响及其机制研究

发布时间：2017-07-19 02:03

  本文关键词：阿司匹林对TNF-α诱导RAW264.7细胞中MMP-9表达的影响及其机制研究

  更多相关文章： 阿司匹林 动脉粥样硬化 基质金属蛋白酶 巨噬细胞

【摘要】：动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是冠脉综合征的病理基础,严重危害人类健康。据统计约有15.4万人患有心脑血管疾病和动脉粥样硬化。在动脉粥样硬化发展过程中伴随炎症的侵袭,导致斑块处活化的巨噬细胞分泌大量的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs),后者可以降解细胞外基质增加心脑血管疾病的发病率和死亡率。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9),是基质金属蛋白酶家族中的一员,不仅可以过度降解基底膜IV型胶原,而且促进炎症反应和血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)的增殖和迁移,导致动脉粥样硬化斑块的不稳定形成血栓。由巨噬细胞分泌的MMP-9是影响动脉粥样硬化斑块形成及稳定性的重要因素,抑制动脉粥样硬化炎症细胞分泌的MMP-9的产生对预防动脉粥样硬化疾病的发生和发展可能是一个新的药物靶点。阿司匹林是常见的非甾体抗炎药,在预防血管动脉硬化中发挥着重要作用。研究表明阿司匹林抑制动脉粥样硬化患者斑块的血管炎症及环氧酶-2的活性,也抑制核因子κB p65(nuclear factor,NF-κBp65)核转录表达。有文献报道,阿司匹林稳定动脉粥样斑块可能与抑制MMP-9表达有关,但相关的作用机制尚未完全清楚。本文以RAW264.7细胞为研究对象,体外研究阿司匹林对TNF-α诱导的RAW264.7细胞中MMP-9的表达及其可能的作用机制。目的:观察阿司匹林对TNF-α诱导RAW264.7细胞中MMP-9的表达,并探讨其可能的作用机制。1.阿司匹林对tnf-α诱导raw264.7细胞中mmp-9的表达和活性影响阿司匹林(75、150、300、600μm)预处理raw264.7细胞1h,加tnf-α(10ng/ml)作用24h,应用mtt法检测阿司匹林对raw264.7的细胞毒性。westernblot和rt-pcr检测阿司匹林对mmp-9蛋白和基因表达情况,明胶酶谱法检测阿司匹林对mmp-9酶活性表达。结果显示,不同浓度的阿司匹林对raw264.7细胞无毒性作用。阿司匹林剂量依赖性地抑制tnf-α诱导的raw264.7细胞中mmp-9的表达和酶活性。2.阿司匹林对mapk信号通路中各磷酸化蛋白的影响及抑制mapk信号通路后mmp-9表达的影响阿司匹林(600μm)预处理raw264.7细胞1h后,加tnf-α(10ng/ml)分别作用60min、30min、20min和10min。westernblot检测mapk信号通路中各蛋白的表达情况:p-erk1/2、erk1/2、p-jnk、jnk、p-p38、p38。结果显示,阿司匹林分别在20min、60min和30min降低p-erk1/2、p-p38和p-jnk蛋白的表达。erk1/2、p38和jnk非磷酸化蛋白表达无明显变化。用特异性阻断剂pd98059(10μm)、sb203580(10μm)和sp600125(20μm)阻断mapk信号通路中erk1/2、p38和jnk通路。以上阻断剂提前1h加入,再加tnf-α(10ng/ml)作用24h。应用westernblot和q-rt-pcr检测mmp-9的蛋白和基因表达情况。结果显示,在mapk信号通路特异性阻断剂存在下,mmp-9的表达明显下降。3.阿司匹林对nf-κbp65核蛋白表达的影响及抑制nf-κb信号通路后mmp-9表达的影响用阿司匹林(75、150、300、600μ)预处理raw264.7细胞1h后,加tnf-α(10ng/ml)作用1h。应用westernblot检测核内p65蛋白表达。结果显示,阿司匹林降低核内p65蛋白的表达。用nf-κb通路特异性阻断剂pdtc(10μm)提前预处理细胞1h后,加tnf-α(10ng/ml)作用1h,应用westernblot和q-rt-pcr检测mmp-9的蛋白和基因表达。结果显示,加pdtc阻断剂后,mmp-9的蛋白和基因表达均下降。结论:阿司匹林对细胞无毒性作用且抑制tnf-α诱导的raw264.7细胞中mmp-9的表达。另外,阿司匹林抑制TNF-α诱导RAW264.7细胞中MMP-9表达的机制可能与调节MAPK和NF-κB信号转导通路相关蛋白有关。
【关键词】：阿司匹林 动脉粥样硬化 基质金属蛋白酶 巨噬细胞
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中英文缩略词对照5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-14
• 1.实验材料14-19
• 2.实验方法19-31
• 2.1 细胞培养19
• 2.2 MTT试验19-21
• 2.3 PCR21-24
• 2.4 Western Blot24-29
• 2.5 明胶酶谱试剂盒检测 MMP-9 酶活性29-30
• 2.6 统计学处理30-31
• 3.结果31-44
• 3.1 阿司匹林对RAW264.7 细胞的毒性作用31-32
• 3.2 阿司匹林对TNF-α 诱导RAW264.7 细胞中MMP-9 的抑制作用32-35
• 3.3 阿司匹林对MAPK信号通路相关蛋白的表达35-38
• 3.4 MAPK信号通路各抑制剂对MMP-9 表达的影响38-40
• 3.5 阿司匹林对p65 蛋白表达的影响40-42
• 3.6 NF-κB通路抑制剂对MMP-9 表达的影响42-44
• 4.讨论44-47
• 5.结论47
• 参考文献47-54
• 附录54-55
• 致谢55-57
• 综述57-66
• 参考文献62-66

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本文编号：560706