莪术醇抗乳腺癌转移作用及潜在靶标的蛋白质组学分析

发布时间：2017-07-27 12:06

  本文关键词：莪术醇抗乳腺癌转移作用及潜在靶标的蛋白质组学分析

  更多相关文章： 莪术醇 基质金属蛋白酶-9 迁移 侵袭 蛋白质组学

【摘要】：背景:乳腺癌是当今世界女性最多发的恶性肿瘤之一。2016年《Cancer Statistics》数据显示,2015年美国女性癌症发病率中乳腺癌以29%的比率独占鳌头,死亡率仅次于肺癌,居第二位。在中国,2009-2011年间女性癌症发病率显著增加。其中,乳腺癌位居第一位,且呈逐年增加态势。中药莪术在传统上用于治疗宫颈癌、乳腺癌等妇科肿瘤,莪术油被认为是主要的活性物质基础,其中莪术醇是代表性化合物之一。目前,莪术醇抑制肿瘤转移的报道还很少,其潜在分子机制还需要深入研究。本课题获得了中央高校基础研究重点项目基金(XDJK2014B044)的支持。目的:进一步明确莪术醇在抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭与粘附方面的作用,深入地阐明其可能的新型分子机制和分析潜在的靶标蛋白。方法:利用磺酰罗丹明B(SRB)法检测细胞存活率,平板克隆实验检测细胞生长状况。采用Ibidi划痕实验和Transwell迁移实验评价乳腺癌细胞体外的迁移能力。通过Transwell侵袭实验明确莪术醇对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。利用Matrigel粘附实验评价乳腺癌细胞粘附基底膜的能力。免疫印迹法(Western Blot)检测相关蛋白的表达,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶的活性。采用双荧光素酶报告基因技术检测莪术醇对NF-κB转录活性的影响。采用二维凝胶电泳技术分离莪术醇与溶剂对照处理后的MDA-MB-231细胞蛋白,分析差异表达蛋白,切取差异表达的蛋白点,并通过MALDI-TOF/TOF进行鉴定。利用Gene Ontology(GO)分析法明确差异蛋白的功能类别,利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析所涉及的相关通路,分析出可能与莪术醇抗乳腺癌转移作用相关的靶标,再利用Protein-Protein Interaction prediction(PPI)法找出与潜在靶标相互作用的蛋白质。最后,采用RT-PCR方确认在m RNA水平莪术醇对潜在蛋白靶标表达的影响。结果:1.莪术醇对乳腺癌细胞迁移、侵袭和粘附的影响SRB法检测莪术醇细胞毒性显示,当莪术醇浓度小于40μg/ml作用24 h后对MDA-MB-231和4T1细胞无细胞毒性。连续处理14天后,40μg/ml莪术醇可显著抑制克隆的形成。为排除细胞毒性的影响,本研究选用10、20、40μg/ml浓度的莪术醇进一步明确其体外抗乳腺癌细胞迁移、侵袭和粘附能力。Transwell迁移实验和Ibdi划痕实验结果表明,莪术醇处理MDA-MB-231细胞8 h后,其体外迁移能力显著降低。Transwell侵袭实验结果显示,莪术醇能够显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力。粘附实验结果表明,莪术醇能明显降低MDA-MB-231细胞粘附能力。2.莪术醇抗乳腺癌细胞转移可能与JNK/Akt/NF-κB介导的MMP-9信号转导通路相关明胶酶谱结果显示,莪术醇作用MDA-MB-231细胞24 h后,MMP-9酶活性降低。Western Blot分析显示,莪术醇处理MDA-MB-231细胞后,MMP-9蛋白表达降低,JNK1/2、Akt磷酸化水平降低。同时,莪术醇亦抑制了NF-κB p65蛋白的核转移与转录活性。并且,JNK1/2抑制剂SP600125和PI3K-Akt抑制剂LY294002能够分别增强莪术醇对NF-κB p65蛋白核转移的抑制作用。同时,JNK1/2抑制剂SP600125、PI3K-Akt抑制剂LY294002和NF-κB抑制剂PDTC均能分别显著增强莪术醇对MDA-MB-231细胞MMP-9蛋白表达的抑制作用以及莪术醇对MDA-MB-231细胞迁移、侵袭和粘附的抑制作用。3.蛋白质组学技术鉴定莪术醇抗乳腺癌转移作用的潜在靶标采用二维凝胶电泳技术分离莪术醇与溶剂对照作用的MDA-MB-231细胞蛋白,共发现了19个差异蛋白,采用MALDI-TOF/TOF生物质谱成功鉴定了其中11个蛋白。GO分析显示,此11种蛋白分布在不同的细胞结构中,参与了多种重要的生物过程,表现出不同的分子功能。KEGG分析可知,鉴定的11种蛋白参与到76条信号通路中。特别地,结合GO分析结果,KEGG分析结果和查阅文献发现其中4个蛋白(EEF1A1、NRAS、SUB1、ACAT2)可能与莪术醇抑制MDA-MB-231细胞迁移、侵袭和粘附有关。我们利用PPI分析得到与这4种蛋白相互作用的蛋白。最后,应用RT-PCR对这4个靶标在m RNA水平进行验证,证实了莪术醇能够在转录水平上剂量依赖性地调控这4个蛋白的m RNA水平,与基于二维凝胶技术的蛋白质组学结论相符合。结论:莪术醇具有抑制乳腺癌细胞体外迁移、侵袭和粘附的作用,其调控机制一方面可能与JNK/Akt/NF-κB介导的MMP9信号转导通路有关。另一方面蛋白质组学分析发现EEF1A1、NRAS、SUB1、ACAT2可能是莪术醇抗乳腺癌细胞转移的潜在靶标。
【关键词】：莪术醇 基质金属蛋白酶-9 迁移 侵袭 蛋白质组学
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 文献综述13-19
• 第一章 选题依据19-23
• 1.1．引言19
• 1.2．肿瘤的转移与MMPs19-20
• 1.2.1．肿瘤的侵袭转移19
• 1.2.2．肿瘤的转移与MMPs19-20
• 1.3．莪术醇在乳腺癌治疗方面的研究进展与目前研究存在的问题20
• 1.4．本课题的出发点及研究意义20
• 1.5．课题研究的研究内容及预期结果20-23
• 第二章 莪术醇对乳腺癌细胞迁移、侵袭和粘附的影响23-33
• 2.1．仪器与材料23
• 2.1.1．仪器设备23
• 2.1.2．实验材料23
• 2.2．实验方法23-25
• 2.2.1．主要溶液的配置23-24
• 2.2.2．细胞株的培养24
• 2.2.3．细胞存活率的测定24
• 2.2.4．平板克隆实验24
• 2.2.5．划痕实验24-25
• 2.2.6．Transwell小室侵袭实验25
• 2.2.7．粘附实验25
• 2.2.8．统计分析25
• 2.3．结果25-29
• 2.3.1．莪术醇对乳腺癌细胞MDA-MB-231和 4T1的细胞毒性25-26
• 2.3.2．莪术醇抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭26-29
• 2.3.3. 莪术醇抑制乳腺癌细胞的粘附作用29
• 2.4．讨论29-31
• 2.5．小结31-33
• 第三章 莪术醇抑制乳腺癌细胞转移的基质金属蛋白酶机制研究33-49
• 3.1．仪器与材料33-34
• 3.1.1．仪器设备33
• 3.1.2．实验材料33-34
• 3.2．实验方法34-38
• 3.2.1．主要溶液的配置34-35
• 3.2.2. 细胞株的培养35
• 3.2.3．划痕实验35
• 3.2.4．Transwell小室侵袭实验35
• 3.2.5．粘附实验35-36
• 3.2.6．双荧光素酶报告基因检测36
• 3.2.7．总蛋白提取36
• 3.2.8．核蛋白的提取36
• 3.2.9．Bradford法测定蛋白浓度36-37
• 3.2.10．Western Blot检测分析37-38
• 3.2.11．MMP-9 酶谱活性分析38
• 3.2.12．统计分析38
• 3.3．实验结果38-46
• 3.3.1．莪术醇对MDA-MB-231细胞MMP-9 的抑制以及磷酸化的JNK1/2，，磷酸化的Akt和NF-κB的抑制38-42
• 3.3.2．莪术醇对MMP-9 蛋白的抑制可能与JNK1/2、Akt、NF-κB通路相关2442-43
• 3.3.3．莪术醇对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞迁移、侵袭和粘附的抑制可能与JNK1/2、Akt和NF-κB相关43-46
• 3.4．讨论46-48
• 3.5．小结48-49
• 第四章 蛋白质组学技术分析莪术醇抗乳腺癌转移的潜在作用靶标49-63
• 4.1．主要材料仪器49-50
• 4.1.1．主要材料逑逑49
• 4.1.2．仪器设备49-50
• 4.2．实验方法50-54
• 4.2.1．配液50-51
• 4.2.2．细胞株的培养51
• 4.2.3．药物处理与蛋白的提取51
• 4.2.4．第一向等电聚焦51
• 4.2.5．第二向SDS-PAGE分离51-52
• 4.2.6．银染52
• 4.2.7．考马斯亮蓝染色52
• 4.2.8．图像的扫描分析与凝胶的保存52
• 4.2.9．质谱前处理52
• 4.2.10．MALDI-TOF/TOF质谱分析鉴定52-53
• 4.2.11．总RNA提取53
• 4.2.12．RT-PCR检测53
• 4.2.13．统计分析53-54
• 4.3．实验结果54-59
• 4.3.1．蛋白质组学方法鉴定莪术醇作用的差异表达蛋白54
• 4.3.2．GO分析法分析鉴定的蛋白54-55
• 4.3.3．KEGG法分析鉴定的蛋白55-58
• 4.3.4．莪术醇抑制肿瘤转移相关蛋白的发现和验证58-59
• 4.4．讨论59-61
• 4.5．小结61-63
• 全文总结63-65
• 本课题的创新点65-67
• 思考与展望67-69
• 参考文献69-75
• 中英文缩略名词对照表75-79
• 致谢79-81
• 硕士学位期间科研工作汇报81-82
• 文章发表81
• 获得奖励81-82
• 参加会议82

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本文编号：581317