金黄色葡萄球菌Sortase A小分子抑制剂的研究

发布时间：2017-07-30 09:21

  本文关键词：金黄色葡萄球菌Sortase A小分子抑制剂的研究

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【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)能够引起局部组织化脓感染、肺炎、败血症等疾病,严重威胁着人类的身体健康。近年来,由于抗生素的大量使用甚至滥用,使得医院和社区中出现了大量的耐药病原菌,如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistant S.aureus,MRSA)和耐万古霉素金黄色葡萄球菌(Vancomycin Resistant S.aureus,VRSA)。目前,细菌的耐药性已经成为日益严峻的全球性公共卫生问题,对于抗菌感染新类型药物的研发已经刻不容缓。抗生素主要通过杀菌或抑制细菌生长来达到治疗细菌感染的效果,但同时也会影响宿主体内的益生菌的生存状态,破坏体内的微生态平衡,从而产生对宿主有害的副作用。近年来,抗毒力治疗(Anti-virulence therapies)作为新型抗细菌感染的策略,可以通过干预细菌的致病能力而非直接杀死细菌来达到治疗效果,是目前抗细菌感染药物研究的前沿热点。在革兰氏阳性菌内,转肽酶Sortase A(SrtA)主要负责将20多种表面毒力因子蛋白锚定到细菌的细胞壁上。据报道srtA基因与革兰氏阳性菌的致病力密切相关,但其并不是细菌生存与生长所必需的。因此抑制SrtA的活性不会对病原菌带来生存压力,并且在临床上也可能会降低针对抑制SrtA转肽活性的耐药性菌株出现的机率。综上所述,S.aureus SrtA(SaSrtA)是抗细菌毒力因子潜在的药物作用候选靶标。合作实验室以Pyranonaphthoquinone类天然产物的结构中参与生物还原烷基化过程的苯醌并吡喃内酯类三环为关键母核骨架,对其进行结构优化,合成了大约200个化合物。本论文利用荧光共振能量转移技术构建SaSrtA小分子抑制剂的筛选体系,针对这200个化合物筛选能够干预SaSrtA转肽反应活性的小分子抑制剂,最终我们得到了16个具有较好抑制活性的化合物,IC_(50)在2-80μM之间。基于化合物的理化性质和抑制活性考虑,对化合物SOMCL-14-283及其相差异构体SOMCL-14-284开展进一步的体外研究:(1)SDS-PAGE的转肽实验结果显示两个化合物均抑制SaSrtA对底物蛋白质(Sa IsdA)的转肽活性,并且化合物SOMCL-14-283的抑制活性比SOMCL-14-284的活性提高3倍左右,这与通过荧光共振能量转移测得的IC_(50)具有一致性;(2)质谱结果显示,化合物SOMCL-14-283不可逆共价修饰SaSrtA的Cys184位点。(3)圆二色谱(CD)揭示SOMCL-14-283在最高浓度为400μM时对SaSrtA蛋白质的二级结构没有显著的影响。随后,细菌细胞上,利用FITC-IGg和western blot的技术检测细胞壁SpA的含量,发现可以显著降低金黄色葡萄球菌细胞壁SpA的锚定量。在150μM浓度下,两个化合物对金黄色葡萄球菌的生长几乎没有影响以及MIC值也均大于200μM。此外,我们发现SOMCL-14-283还具有抑制广谱革兰氏阳性菌SrtA的活性。本论文以发现新靶标和新机制的新型抗菌感染活性化合物为目标,针对与致病力密切相关的SrtA进行高通量筛选评价以及结构改造的合作研究,发现了具有明确抑制SrtA活性的化合物SOMCL-14-283,并进一步研究了其抑制SaSrtA活性的分子机制。因此,本研究为开发与传统抗生素作用机制不同的新型抗菌药物提供了有意义的尝试以及为SrtA共价抑制剂的设计与筛选提供了新的方向。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 SrtA转肽酶 致病性 共价抑制剂
【学位授予单位】：中国科学院上海药物研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 前言13-31
• 1.1 金黄色葡萄球菌感染现状13-16
• 1.1.1 病原菌耐药形势迫切需要抗菌新药研发13-14
• 1.1.2 抗生素研发历史进程和未来趋势14-15
• 1.1.3 基于抗-致病力（Anti-virulence）策略的抗菌药物研发成为热点15-16
• 1.2 SaSrtA是一个理想的抗致病力的靶标16-18
• 1.3 SaSrtA的结构18-20
• 1.4 SaSrtA的抑制剂研究进展20-31
• 1.4.1 Diarylacrylonitriles21-22
• 1.4.2 Aryl( β-amino )ethyl Ketones22-23
• 1.4.3 Rhodanines、Pyridazinones和Pyrazolethiones23-25
• 1.4.4 Morpholinobenzoate衍生物25-26
• 1.4.5 Dihydro-β-carboline26-27
• 1.4.6 Benzo[d]isothiazol-3(2H)-one-adamantane衍生物27-28
• 1.4.7 绿原酸（CHA）和栎素（QEN）28-29
• 1.4.8 3,6-Disubstituted Triazolothiazoles29-31
• 第二章 实验材料和实验方法31-49
• 2.1 实验材料31-35
• 2.1.1 实验所用质粒和菌株31
• 2.1.2 实验动物31
• 2.1.3 实验所用试剂31-32
• 2.1.4 实验所用仪器32-34
• 2.1.5 实验所用试剂的配制34-35
• 2.2 实验方法35-49
• 2.2.1 转肽酶SaSrtA蛋白的表达35
• 2.2.2 转肽酶SaSrtA蛋白的纯化35-36
• 2.2.3 转肽酶SaSrtA的转肽活性测定36-37
• 2.2.4 SaSrtA酶活水平的抑制剂筛选37
• 2.2.5 活性化合物的IC_(50)测定37-38
• 2.2.6 化合物的可逆性抑制的研究38
• 2.2.7 动力学测试实验38-39
• 2.2.8 SDS-PAGE转肽活性实验39-40
• 2.2.9 转肽酶SaSrtA的晶体培养、结构解析及其与化合物SOMCL14283共结晶40
• 2.2.10 圆二色谱（CD）40-41
• 2.2.11 基于FITC-IGg检测化合物对细胞壁上的SPA含量的影响41
• 2.2.12 荧光标记的热迁移实验（Fluorescence-Based Thermal Shift Assay）41-42
• 2.2.13 Western Blotting 检测化合物对细胞壁上的 SPA 含量的影响42-43
• 2.2.14 高分辨蛋白质相对分子质量分析43-44
• 2.2.15 FASP酶解肽断质谱实验44-45
• 2.2.16 化合物对细菌生长的影响45-46
• 2.2.17 化合物的动物急性毒性试验46
• 2.2.18 金黄色葡萄球菌感染动物（小鼠）实验46-49
• 第三章 实验结果及讨论49-71
• 3.1 SaSrtA蛋白的纯化49-50
• 3.2 测定SaSrtA的米氏方程及Km值50
• 3.3 小分子抑制剂IC_(50)的测定50-53
• 3.4 基于SDS-PAGE对化合物抑制SaSrtA进行进一步验证53-55
• 3.5 小分子抑制剂与SaSrtA的作用模式55-56
• 3.6 利用质谱检测化合物与SaSrtA的作用方式为不可逆的共价结合56-58
• 3.6.1 化合物完全抑制SaSrtA的活性所需要的比例56-57
• 3.6.2 质谱分析57-58
• 3.7 FASP酶解肽断二级质谱确定化合物与SaSrtA的184位半胱氨酸不可逆共价结合58-59
• 3.8 化合物与SaSrtA共价结合的动力学曲线59-60
• 3.9 圆二色谱（CD）60-61
• 3.10 运用FITC-IGg的方法检测金黄色葡萄球菌细胞壁上的SPA含量验证化合物在活体水平上的抑制活性61-63
• 3.11 通过western blot的方法进一步验证化合物在活体水平上的抑制活性63-65
• 3.12 化合物对细菌生长的影响65-67
• 3.12.1 化合物对Sa. Newman、Sa. 8325-4、Se. 1457、Bs. 681、Ec. DH5α的最小抑制细菌浓度（MIC）65-66
• 3.12.2 化合物SOMCL14283、SOMCL14284对金黄色葡萄球菌的生长曲线66-67
• 3.13 化合物的动物毒性实验67-68
• 3.14 小鼠感染模型68
• 3.15 检测化合物SOMCL14283与化合物SOMCL14284对其它革兰氏阳性菌株的转肽酶Sa SrtA的抑制作用68-71
• 第四章 实验总结与讨论71-75
• 4.1 实验总结71-72
• 4.2 讨论72-75
• 参考文献75-85
• 附录85-87
• 简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果87

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本文编号：593524