藤黄酸接枝低分子肝素自组装胶束的制备及评价

发布时间：2017-08-08 08:14

  本文关键词：藤黄酸接枝低分子肝素自组装胶束的制备及评价

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【摘要】：研究目的:课题选用亲水性的天然多糖低分子肝素与藤黄酸共价结合,在溶液中自组装形成两亲性聚合物胶束,改善藤黄酸的水溶性以及稳定性;建立体内药物含量分析方法,考察胶束在小鼠体内的分布及靶向性;建立小鼠原位肝癌移植模型,考察胶束的抗肿瘤作用。实验方法:(1)藤黄酸-低分子肝素接枝物(GA-LMWH)的制备及表征:通过藤黄酸与低分子肝素反应,得到GA-LMWH两亲性共聚物;经单因素考察和正交试验确定最优合成工艺;利用紫外分光光度计测定藤黄酸接枝低分子肝素的取代度,通过红外、DSC、电镜、粒度仪等对自组装胶束的结构、粒径、电位、CMC值等方面进行表征。(2)GA-LMWH胶束在小鼠体内的组织分布研究:考察胶束在离体血浆中的稳定性,评价GA-LMWH胶束在小鼠体内的靶向作用,以FITC标记肝素,得到粒径范围在200nm左右的GA-LMWH-FITC胶束;经鼠尾静脉注射后,利用多功能酶标仪检测不同时间点各组织中的荧光强度,根据统计距药动学参数得到各组织的药时曲线下面积、靶向效率、平均滞留时间等,评价自组装胶束的靶向性。(3)GA-LMWH自组装胶束的抗肿瘤作用研究:利用H22腹水瘤细胞建立肝癌原位移植瘤模型,通过肝功能检测与组织切片病理学观察以及存活时间曲线比较藤黄酸溶液与GA-LMWH胶束的抗肿瘤疗效差异。实验结果:(1)肝素-藤黄酸接枝物(GA-LMWH)的制备及表征:经单因素考察及正交试验得出最优处方,其具体条件为活化中间体酯的温度为0℃、乙二胺的加入量为200mL(藤黄酸的投料量为0.3mmol时)、反应物的摩尔数投料比为n(肝素钠):n(藤黄酸):n(EDCI)=1:20:10。红外及DSC图谱表明产物成功合成,通过紫外检测,GA-LMWH的取代度为(27.45±0.22913)%;电镜观察胶束的形态均一,利用纳米粒度仪检测其粒径范围在200nm左右,电位-30m V,说明胶束结构稳定;荧光分光光度计测得CAC值为(0.0024±0.00019)mg×m L-1。(2)GA-LMWH自组装胶束在小鼠体内的药动学研究:血浆稳定性试验表明,胶束在血浆中稳定存在24小时。将低分子肝素用FITC标记,得到具有荧光特性的GA-LMWH-FITC胶束,尾静脉注射小鼠体内后,胶束的肝脏富集效应显著,且体内平均滞留时间MRT是GA溶液MRT的6倍。(3)GA-LMWH的抗肿瘤效应研究:抗肿瘤试验表明,低分子肝素组与模型组在肝功能评价和生存时间上比较并没有显著性差异(p0.05),表明本实验中低分子肝素溶液对肿瘤没有直接抑制作用,虽然GA-LMWH胶束组和GA溶液组的肝功能指标均没有恢复至正常值,但与模型组和低分子肝素组比较均有明显降低(p0.05),GA-LMWH胶束组在谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶AST这两项肝功能指标与GA溶液组比较有显著性差异的降低(p0.05),生命曲线较GA溶液组有所延长(p0.05)。结论:通过化学合成的方法将藤黄酸接枝到低分子肝素上形成两亲性共聚物,其水溶液中自组装成纳米级胶束;能够被动富集于肝脏部位的作用显著,且延长了体内滞留时间,GA-LMWH胶束保留了藤黄酸的抗肿瘤活性,原位移植瘤实验也表现出较藤黄酸溶液更好的抗肿瘤效果。
【关键词】：藤黄酸 自组装胶束 肝靶向 组织分布 抗肿瘤
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 中文摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 英文缩略词表14-15
• 前言15-20
• 第一章 藤黄酸接枝低分子肝素（GA-LMWH）自组装胶束的制备及表征20-38
• 1.仪器与试药20-21
• 1.1 仪器20
• 1.2 试药20-21
• 2.GA-LMWH的制备与结果21-28
• 2.1 GA-LMWH合成总路线21
• 2.2 藤黄酸乙二胺单酰胺的合成21
• 2.3 藤黄酸-低分子肝素接枝物的合成21-22
• 2.4 GA-LMWH胶束的制备22
• 2.5 GA-LMWH胶束合成条件的单因素考察及工艺筛选22-26
• 2.5.1 催化剂的选择22-23
• 2.5.2 反应溶剂的选择23
• 2.5.3 合成GA-LMWH载体的选择23-24
• 2.5.4 合成活性中间体温度的选择24-25
• 2.5.5 藤黄酸乙二胺单酰胺的合成中乙二胺的用量25
• 2.5.6 反应物投料比的选择25-26
• 2.6 单因素考察得到出的制备条件26-28
• 3.GA-LMWH自组装胶束的表征28-37
• 3.1 傅里叶红外吸收光谱(FTIR)28-29
• 3.2 差示扫描量热分析29-30
• 3.3 胶束的形态粒径与电位30-31
• 3.4 自组装胶束临界聚集浓度的测定31-33
• 3.4.1 自组装胶束临界聚集浓度的测定原理31-32
• 3.4.2 临界聚集浓度的测定32
• 3.4.3 自组装胶束的CAC值的测定结果32-33
• 3.5 GA-LMWH取代度的测定33-37
• 3.5.1 藤黄酸分析方法的建立33-35
• 3.5.2 藤黄酸标准曲线的绘制35
• 3.5.3 重现性实验35-36
• 3.5.4 藤黄酸取代度的测定36
• 3.5.5 藤黄酸取代度的测定结果36-37
• 4.讨论37
• 5.本章小结37-38
• 第二章 藤黄酸接枝低分子肝素自组装胶束的药动学组织分布实验38-69
• 第一节 藤黄酸接枝低分子肝素自组装胶束的血浆稳定性38-47
• 1 仪器、试药与动物38-39
• 1.1 仪器38
• 1.2 试剂与药品38
• 1.3 实验动物38-39
• 2.方法与结果39-45
• 2.1 分析方法的建立39-43
• 2.1.1 色谱条件39
• 2.1.2 实验所需血浆样品的收集39
• 2.1.3 标准曲线制备39-40
• 2.1.4 方法专属性考察40-42
• 2.1.5 藤黄酸在血浆中的精密度实验42
• 2.1.6 方法回收率实验42-43
• 2.2 血浆稳定性试验43-45
• 2.2.1 血浆稳定性实验步骤43-44
• 2.2.2 统计学分析44
• 2.2.3 血浆稳定性实验结果44-45
• 3 讨论45-47
• 第二节 荧光物质标记藤黄酸接枝低分子肝素自组装胶束的制备47-54
• 1 仪器与试药47
• 1.1 仪器47
• 1.2 试剂与药品47
• 2 方法与结果47-52
• 2.1 荧光物质的选择、荧光标记GA-LMWH的原理及流程图47-49
• 2.2.GA-LMWH-FITC合成步骤49-50
• 2.2.1 低分子肝素的活化49
• 2.2.2 FITC标记低分子肝素钠的制备49-50
• 2.2.3 FITC标记GA-LMWH的合成50
• 2.3 GA-LMWH-FITC的合成结果50-52
• 2.3.1 GA-LMWH-FITC的红外图谱50-51
• 2.3.2 GA-LMWH-FITC的粒径分布51-52
• 3 讨论52-54
• 第三节 藤黄酸接枝低分子肝素自组装胶束在小鼠体内的组织分布研究54-69
• 1 仪器、试药与动物54-55
• 1.1 仪器54
• 1.2 药品与试剂54
• 1.3 实验动物54-55
• 2 方法与结果55-68
• 2.1 荧光检测条件55
• 2.2 实验数据处理及统计学分析55
• 2.3 血浆样品的制备55
• 2.3.1 空白血浆的制备55
• 2.3.2 含荧光胶束的血浆样品制备55
• 2.3.3 给药后血浆样品的制备55
• 2.4 组织样品的制备55-56
• 2.4.1 空白组织样品的制备55-56
• 2.4.2 含荧光胶束组织样品的制备56
• 2.4.3 给药小鼠的组织处理56
• 2.5 血浆及各组织标准曲线的制备56-59
• 2.6 精密度实验59
• 2.7 相对回收率实验59
• 2.8 稳定性实验59-62
• 2.9 给药方法与生物样品的采集62-64
• 2.10 药动学分析及靶向性研究64-68
• 2.10.1 利用药动学参数分析组织靶向性64-67
• 2.10.2 GA-LMWH-FITC体内分布的荧光切片观察67-68
• 3 讨论68
• 4 本章小结68-69
• 第三章 藤黄酸接枝低分子肝素自组装胶束的体内抗肿瘤作用研究69-79
• 1.仪器、材料与动物69
• 1.1 仪器69
• 1.2 材料69
• 1.3 实验动物69
• 2.方法与结果69-77
• 2.1 小鼠原位肝癌移植69-71
• 2.1.1 体内H22细胞传代69-70
• 2.1.2 小鼠原位肝癌模型建立70-71
• 2.2 体内抗肿瘤实验71-77
• 2.2.1 分组与给药71
• 2.2.2 肝功能检测71-72
• 2.2.3 体重变化及器官指数变化趋势72-73
• 2.2.4 肝脏组织的病理观察73-76
• 2.2.5 存活时间与生存率分析76-77
• 3.讨论77-78
• 4.本章小结78-79
• 全文总结79-81
• 参考文献81-85
• 综述85-97
• 参考文献91-97
• 个人简介97
• 攻读硕士学位期间发表论文情况97-98
• 致谢98

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