基于DNA分子识别探针及信号扩增策略的博来霉素检测新方法研究
本文关键词：基于DNA分子识别探针及信号扩增策略的博来霉素检测新方法研究
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【摘要】：博来霉素,是一种重要的抗癌药物,疗效显著且具有低骨髓抑制和低免疫抑制的优势,被广泛应用于多种癌症的治疗,如鳞状细胞癌、生殖细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、子宫颈癌以及恶性淋巴瘤等。博来霉素的治疗窗较窄,且由于个体差异,相同剂量的药物在不同的患者体内会表现出不同的血药浓度。因此,博来霉素血药浓度监测对于制定合理有效的临床给药方案、提高其抗癌疗效以及降低毒副作用具有重要意义。博来霉素具有选择性裂解DNA链的性质,因此利用特定DNA链作为反应底物识别博来霉素,可以建立基于DNA纳米技术的生物传感方法,用于博来霉素的灵敏、特异检测。相比于其他检测技术,基于DNA纳米技术的生物传感方法具有灵敏、特异、操作简单及可程序化设计的优势。本论文以DNA纳米技术为基础,设计并构建了新型的博来霉素DNA识别探针,结合酶介导的信号放大策略,建立了新型的生物传感分析方法,并将其用于博来霉素灵敏、特异、免标及快速检测。本论文第一章为绪论部分,对博来霉素的发现和临床应用、博来霉素裂解DNA链的机理及博来霉素检测方法进行了概述。并对生物传感技术中常用的DNA分子识别探针和酶介导的等温信号扩增策略进行了介绍。本论文第二章,设计并构建了一种新型的博来霉素识别探针——双环发夹探针,并利用该探针建立一种荧光生物传感器,实现了博来霉素的免标记、灵敏检测。双环发夹探针包含两个功能区域：博来霉素识别位点5'-GTGC-3’和DNA触发序列。首先,博来霉素能够特异性识别该探针,并将其切割,释放触发序列。过量的探针则能够通过DNA分子内杂交将DNA触发序列沉默,从而降低方法的背景。接着,触发序列触发循环的链取代扩增反应(SDA),实现检测信号的放大,检测限达0.34 nM,线性范围为2 nM-220 nM,且首次实现了博来霉素的免标记检测。该方法能够准确区分博来霉素及其它抗肿瘤药物,具有良好的选择性。此外,方法的人血清回收率均在为95%-99%之间,说明该方法的准确性良好。但临床实验表明,在静脉注射给药方式下,人体内博来霉素血药浓度变化范围(24 h)为1.4nM-2.7μM,因此本方法的灵敏度仍不能满足临床血药浓度监测的需要。为了进一步提高博来霉素检测方法的灵敏度,本论文第三章利用双环发夹探针介导的级联信号扩增策略,建立了多重放大荧光传感体系,实现了博来霉素的高灵敏、免标记检测。该方法中,博来霉素识别并切割双环发夹探针,释放DNA触发序列。接着触发序列介导链取代扩增反应(SDA)和指数扩增反应(EXPAR),实现信号的级联放大。本方法的检测达35 pM,线性范围为40 pM-10 nM,能够满足临床24 h内患者血药浓度监测对方法灵敏度的要求。该方法能够准确区分博来霉素及其它抗肿瘤药物,具有良好的选择性。同时方法在人血清中的回收率为95%-97%,说明本方法具有良好的准确性,能够用于实际样品中博来霉素的定量检测。
【关键词】：博来霉素 DNA分子识别探针 信号扩增 荧光传感器
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：
- 中文摘要10-12
- ABSTRACT12-14
- 符号说明14-15
- 第一章 绪论15-36
- 1.1 博来霉素的发现及临床应用15-17
- 1.2 博来霉素的抗癌作用机理17-18
- 1.3 博来霉素检测方法研究进展18-23
- 1.4 DNA分子识别探针23-31
- 1.4.1 具有催化活性的DNA酶24-26
- 1.4.2 适体DNA26-30
- 1.4.3 其他30-31
- 1.5 酶介导的等温信号扩增策略31-35
- 1.5.1 链置换扩增反应32-34
- 1.5.2 滚环扩增反应34-35
- 1.6 本论文的研究目的和研究内容35-36
- 1.6.1 研究目的35
- 1.6.2 研究内容35-36
- 第二章 双环发夹探针介导的链置换扩增策略用于免标记检测博来霉素36-55
- 2.1 引言36-37
- 2.2 实验部分37-39
- 2.2.1 试剂37-39
- 2.2.2 仪器与装置39
- 2.3 实验步骤39-42
- 2.3.1 高温高压灭菌39-40
- 2.3.2 DNA的分装及储存40
- 2.3.3 博来霉素的活化及双环发夹探针的裂解反应40
- 2.3.4 链置换扩增反应40
- 2.3.5 荧光测量40-41
- 2.3.6 聚丙烯酰氨凝胶电泳实验41-42
- 2.4 结果和讨论42-54
- 2.4.1 实验原理42-43
- 2.4.2 博来霉素检测体系的可行性分析43-44
- 2.4.3 博来霉素检测体系反应条件的优化44-49
- 2.4.3.1 双环发夹探针碱基序列设计的优化45-46
- 2.4.3.2 双环发夹探针浓度优化46-47
- 2.4.3.3 信号探针浓度优化47
- 2.4.3.4 酶浓度优化47-48
- 2.4.3.5 NMM浓度优化48-49
- 2.4.4 博来霉素检测体系的分析效能49-54
- 2.4.4.1 检测体系的灵敏度和线性范围49-51
- 2.4.4.2 精密度51-52
- 2.4.4.3 特异性考察52
- 2.4.4.4 在复杂生物基质中的检测性能以及回收率考察52-54
- 2.5 小结54-55
- 第三章 酶介导的级联扩增策略用于高灵敏且免标记检测博来霉素55-72
- 3.1 引言55-56
- 3.2 实验部分56-58
- 3.2.1 材料与试剂56-58
- 3.2.2 仪器与装置58
- 3.3 实验步骤58-60
- 3.3.1 高温高压灭菌58
- 3.3.2 博来霉素切割双环发夹探针58-59
- 3.3.3 酶介导的级联扩增反应59
- 3.3.4 荧光测量59-60
- 3.4 结果和讨论60-71
- 3.4.1 实验原理60-61
- 3.4.2 酶介导的级联扩增体系可行性分析61-62
- 3.4.3 酶介导的级联扩增策略反应条件的优化62-67
- 3.4.3.1 模板链HP_1碱基序列优化62-63
- 3.4.3.2 模板链HP_2碱基序列优化63-64
- 3.4.3.3 模板链HP_2浓度的优化64-65
- 3.4.3.4 模板链HP_3浓度的优化65-66
- 3.4.3.5 酶介导的级联扩增策略反应时间的优化66-67
- 3.4.4 酶介导的级联扩增体系的分析效能67-71
- 3.4.4.1 灵敏度和线性范围考察67-68
- 3.4.4.2 精密度考察68-69
- 3.4.4.3 选择性考察69-70
- 3.4.4.4 复杂生物体系回收率实验70-71
- 3.5 小结71-72
- 结论72-73
- 参考文献73-90
- 致谢90-91
- 硕士期间发表论文91-92
- 学位论文评阅及答辩情况表92
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