化疗药物伊立替康对腹腔巨噬细胞的毒性和机制研究

发布时间：2017-08-14 02:36

  本文关键词：化疗药物伊立替康对腹腔巨噬细胞的毒性和机制研究

  更多相关文章： 伊立替康 腹腔常驻巨噬细胞 细胞凋亡 GATA6 B-1细胞

【摘要】：目的:伊立替康(Irinotecan,CPT-11)是喜树碱的半合成衍生物,是治疗转移性结直肠癌的一线化疗药物。其活性代谢产物SN-38通过抑制拓扑异构酶I从而起到抗肿瘤作用。研究表明它应用于临床治疗癌症,提高化疗有效率的同时还可诱发严重的恶心、呕吐、迟发性腹泻甚至溃疡等肠炎症状。并且,CPT-11引发腹泻、肠炎等毒副作用的机制尚不明确,尤其对腹腔巨噬细胞的毒副作用研究还很少。本课题通过腹腔注射CPT-11,检测CPT-11对小鼠腹腔巨噬细胞组成及表型影响,并探讨其诱导腹腔常驻型巨噬细胞凋亡的机制。鉴于腹腔常驻型巨噬细胞与B-1细胞及肠道稳态的关系,本论文还研究CPT-11对B-1细胞的影响,从而初步探讨CPT-11引发腹泻、肠炎等毒副作用的机制。方法:1.体外实验:采用改进的MTT法(WST-1)检测CPT-11对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞增殖的影响;利用Hoechst 33342染色观察细胞核形态;并用碘化丙啶(PI)染色结合流式细胞术分析CPT-11对RAW 264.7细胞周期及细胞凋亡的影响;免疫印迹法检测CPT-11对RAW 264.7细胞中cleaved caspase-3、PARP(聚腺苷二磷酸核糖聚合酶)及细胞周期相关蛋白的影响。2.动物实验:通过腹腔注射CPT-11,每天监测小鼠体重,96 h后处死小鼠,苏木精-伊红染色(HE染色)分析小鼠结肠和空肠炎症状态;利用流式细胞术分析小鼠腹腔巨噬细胞表面分子CD11b、F4/80和MHC II,B细胞表面分子CD19和CD23的表达;并用PI染色结合流式细胞术分析小鼠腹腔巨噬细胞周期及细胞凋亡的影响;利用免疫荧光显微技术分析小鼠腹腔巨噬细胞中转录因子gata6及凋亡执行蛋白酶cleavedcaspase-3表达的变化;免疫印迹法检测小鼠腹腔巨噬细胞中cleavedcaspase-3及其底物parp蛋白的变化。结果:1.cpt-11处理呈时间和剂量依赖关系抑制raw264.7细胞的增殖,24h和48h的ic50分别为81.36μmol/l和18.84μmol/l,表明cpt-11对raw264.7细胞有一定毒性。通过cpt-11的处理,raw264.7细胞的体积变大,细胞核增大,部分细胞的细胞核发生碎裂(显示细胞已凋亡),并且使原本贴壁生长、具有伪足的细胞变圆而脱落。cpt-11可诱导raw264.7细胞产生亚二倍体峰(显示dna降解和细胞凋亡),且细胞凋亡率呈浓度依赖性上升。同时,处于g2/m期细胞呈浓度依赖性增多。cpt-11可诱导raw264.7细胞中caspase-3的活化,使其底物parp水平下降,同时上调细胞周期蛋白cyclinb1,下调cyclind1的表达。2.cpt-11能明显诱导小鼠体重下降并诱发肠炎。he染色结果显示,经cpt-11处理的小鼠,其结肠和空肠产生炎症病灶,淋巴细胞侵润炎症部位。3.cpt-11下调腹腔中大亚群巨噬细胞的数量,抑制腹腔巨噬细胞中gata6的表达。cpt-11呈剂量依赖性诱导处于g2/m、sub-g0/g1期的腹腔巨噬细胞数量明显增加,显示cpt-11可诱导细胞周期阻滞。cpt-11能使腹腔巨噬细胞中cleavedcaspase-3的含量明显增加,而parp的表达量明显降低,显示细胞正处于凋亡过程中。caspase-3的抑制剂z-devd-fmk能明显拮抗cpt-11抑制gata6表达和下调parp表达量的作用。4.cpt-11处理在影响巨噬细胞的同时,还明显下调腹腔中b细胞、b-1细胞数量。结论:1.cpt-11通过诱导细胞周期阻滞而抑制raw264.7细胞增殖,通过激活caspase-3通路诱导细胞凋亡。2.cpt-11通过诱导腹腔常驻巨噬细胞细胞周期阻滞和依赖caspase-3通路的细胞凋亡来下调腹腔常驻巨噬细胞数量。3.cpt-11抑制腹腔巨噬细胞gata6的表达,可能导致其影响腹腔常驻巨噬细胞功能及腹腔b-1细胞的数量及功能。由于腹腔常驻巨噬细胞和b细胞数量和功能受到抑制,肠道固有免疫功能下降,可能是CPT-11诱导腹泻和肠炎的主要原因。
【关键词】：伊立替康 腹腔常驻巨噬细胞 细胞凋亡 GATA6 B-1细胞
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要3-6
• 英文摘要6-11
• 1 前言11-21
• 1.1 伊立替康（CPT-11）的作用靶点- DNA拓扑异构酶Ⅰ11-12
• 1.2 伊立替康（CPT-11）的代谢过程12-13
• 1.3 伊立替康（CPT-11）的抗肿瘤活性13-14
• 1.4 伊立替康（CPT-11）治疗过程中产生的毒副作用14-15
• 1.5 针对伊立替康（CPT-11）应用过程中缺陷的优化措施15-16
• 1.6 腹腔巨噬细胞的概述16-17
• 1.7 巨噬细胞与肠道稳态的关系17-19
• 1.8 本课题的研究目的及意义19-21
• 2 实验材料和方法21-29
• 2.1 实验材料21-25
• 2.2 实验方法25-29
• 3 实验结果29-40
• 3.1 CPT-11对RAW 264.7 细胞增殖和细胞形态的影响29-30
• 3.2 CPT-11诱导RAW 264.7 细胞凋亡呈剂量依赖性30
• 3.3 CPT-11对RAW 264.7 细胞周期的影响30-31
• 3.4 CPT-11对RAW 264.7 细胞中caspase-3 活化及细胞周期相关蛋白表达的影响31-32
• 3.5 CPT-11能够减少小鼠体重并诱发肠炎32-33
• 3.6 CPT-11下调腹腔中大亚群巨噬细胞的数量33-35
• 3.7 CPT-11对腹腔巨噬细胞中GATA6表达的影响35
• 3.8 CPT-11诱导腹腔巨噬细胞周期阻滞及凋亡35-36
• 3.9 CPT-11激活caspase-3 途径诱导腹腔巨噬细胞细胞凋亡36-37
• 3.10 z-DEVD-fmk抑制CPT-11激活的caspase-3 途径37-38
• 3.11 CPT-11下调腹腔中B-1 细胞数量38-40
• 4 讨论40-43
• 5 全文总结43-44
• 参考文献44-52
• 附录 英文缩略词52-54
• 在学期间发表论文清单54-55
• 致谢55-56

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本文编号：670352