1、抗肿瘤药物海鞘多肽CS5931的表达及分离纯化研究 2、转基因棉花治理土壤重金属污染的研究

发布时间：2017-08-15 22:17

  本文关键词：1、抗肿瘤药物海鞘多肽CS5931的表达及分离纯化研究 2、转基因棉花治理土壤重金属污染的研究

  更多相关文章： 多肽 抗肿瘤 基因表达 分离纯化 棉花 重金属污染 植物修复 ACBP1基因

【摘要】：从萨氏海鞘(Cionasavignyi)中我们分离出了一种新型的具有抗肿瘤活性的多肽,即CS5931,其分子量为5931Da。实验表明,CS5931可以抑制多种癌细胞的生长,可以对人类肝癌细胞BEL-7402进行诱导从而使癌细胞死亡。N-末端序列的分析结果表明,CS5931与人类颗粒体蛋白(granulin, GRN)具有同源性。早期利用分子生物学技术,实验室成功克隆了编码多肽CS5931全长cDNA序列,并因此获得了CS593 1的氨基酸序列,此外还通过基因工程技术对该氨基酸序列进行了重组表达。本研究采用亲和层析法,来获得高纯度的重组多肽CS5931,后期将对该重组多肽进行分子机制及其抗肿瘤活性的研究。我们在实验中将编码多肽CS5931的基因片段连接到了表达载体pET21a(+)上从而构建了表达载体pET21a(+)-CS5931,并且通过将载体转入到含有分子伴侣质粒pG-KJE8的Origami(DE3)中构建了表达体系Origami/pET21a(+)-CS5931+ pG-KJE8,我们对该表达体系进行了诱导并得到了含硫氧还蛋白标签的表达产物重组多肽CS5931-His,且表达产物为可溶性蛋白。随后经变性纯化、复性和蛋白酶酶切,我们得到了纯度不小于95%的带有His-tag的重组多肽CS5931-HiS。重组多肽CS5931-His的His标签位于C-末端,在宿主菌种中的表达形式主要是可溶性形式表达。本课题表明,收集菌体裂解液上清液(含有可溶性表达蛋白),在变性的条件下,经镍离子亲和层析柱亲和、用浓度为50 mM的咪唑洗去杂蛋白,并用浓度为500mM的咪唑洗脱,三步即可获得纯化的重组多肽CS5931-His。重组多肽CS5931-His对癌细胞生长的抑制作用通过MTT法进行了评价。结果显示,CS5931-His对人类宫颈肿瘤细胞Hela、人类结肠肿瘤细胞HCT116和RKO、人类白血病细胞HL60以及人类肺癌肿瘤细胞A549均有较不错的增殖抑制作用。本课题对开发海洋多肽类抗肿瘤新药具有非常重要的价值,而且对建立Enolase 1作为抗肿瘤药物的新靶标也具有重要的意义。2014年3月,民进中央在在全国政协十二届二次会议上提交了关于利用非食用作物修复重金属污染土壤的提案,提案中指出,针对现在我国土壤重金属污染越来越严重的问题,可以利用非食用经济作物,如苎麻、棉花等,工业用油料作物如海甘蓝、蓖麻等,以及其它非食用作物,通过吸收并富集作用将重金属移出土壤,从而达到污染治理与生态恢复的目的,这一提案在修复效果和经济效益方面都具有优势明显,并且同时兼有经济效益和环境效益,易于被接受和推广。棉花是世界上最主要的农作物之一,其产量大而且生产成本低,我国的棉花种植面积基本在500万公顷左右(约合7500万亩),棉花的产量在700万吨左右。长江流域、黄河流域和西北内陆棉区是我国三大棉区,具体包括冀、鲁、豫、陕、晋、津、苏、皖、湘、鄂、赣、新、甘等13个省区。因此,我们选用棉花处理土壤重金属污染具有极大的便利性和可行性。本实验将来自香港大学的ACBP1基因转化至农杆菌LBA4404中,然后利用农杆菌介导法将该基因转入棉花。使棉花的抗重金属能力大大增强,从而起到治理重金属污染的土壤。实验主要探究了农杆菌介导方法以及棉花再生体系的建立。实验选取“石抗434”“大德”“石杂101”三种棉花,最终选定以“石抗”的下胚轴作为基因转化的受体,对愈伤组织培养条件优化,筛选出胚性愈伤组织出愈率高的条件,针对各时期愈伤组织培养的特定需要,考察了碳源、琼脂、不同的激素配比、抗褐化剂等因素,进而优化了适合“石抗434”的遗传转化再生体系。
【关键词】：多肽 抗肿瘤 基因表达 分离纯化 棉花 重金属污染 植物修复 ACBP1基因
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：O629.72;R945
【目录】：

• 第一篇 抗肿瘤药物海鞘多肽CS593的表达及分离纯化研究3-56
• 摘要3-4
• ABSTRACT4-13
• 第一章 文献综述13-20
• 1.1 多肽类药物的抗肿瘤研究进展13-15
• 1.1.1 抗肿瘤多肽的来源13-15
• 1.1.2 抗肿瘤多肽的发展瓶颈15
• 1.2 海鞘抗肿瘤药物的作用机制与研究进展15-17
• 1.3 CS5931的分离技术-亲和层析技术的研究进展17-19
• 1.3.1 亲和层析的类型17
• 1.3.2 固定化金属离子亲和层析17-19
• 1.3.2.1 固定化金属离子亲和层析的基本原理17-18
• 1.3.2.2 固定化金属离子亲和层析柱的制法18
• 1.3.2.3 固定化金属离子亲和层析的优点18
• 1.3.2.4 金属螯合亲和层析分离纯化变性蛋白18-19
• 1.4 本课题研究的目的和意义19-20
• 第二章 抗肿瘤多肽CS5931的克隆20-34
• 2.1 实验材料20-23
• 2.1.1 实验用萨氏海鞘20-21
• 2.1.2 质粒与菌株21
• 2.1.3 引物21
• 2.1.4 实验设备21-22
• 2.1.5 实验试剂22
• 2.1.6 相关溶液的配制22-23
• 2.2 实验方法23-29
• 2.2.1 萨氏海鞘总RNA的提取23
• 2.2.2 3'RACE23-25
• 2.2.3 5'RACE25-28
• 2.2.4 PCR产物胶回收28
• 2.2.5 PCR产物与克隆载体的连接和转化28-29
• 2.2.6 测序、生物信息学分析和3D模型预测29
• 2.3 实验结果29-32
• 2.3.1 萨氏海鞘总RNA的质量分析29-30
• 2.3.2 编码多肽CS5931基因的cDNA3'和5'末端片段的分离30
• 2.3.3 编码多肽CS5931的基因的克隆30-31
• 2.3.4 编码多肽CS5931的基因的序列分析31-32
• 2.4 分析与讨论32-34
• 第三章 抗肿瘤多肽CS5931的表达34-46
• 3.1 实验材料34-37
• 3.1.1 质粒与菌株34-35
• 3.1.2 培养基35
• 3.1.3 引物35
• 3.1.4 实验设备35
• 3.1.5 实验试剂35-36
• 3.1.6 相关溶液的配制36-37
• 3.2 实验方法37-42
• 3.2.1 原核表达载体的构建37-39
• 3.2.2 大肠杆菌(E.COLI)ORIGAMI(DE3)感受态细胞的制备39-40
• 3.2.3 重组载体的转化40
• 3.2.4 重组多肽CS5931在大肠杆菌中的诱导表达和检测40-42
• 3.2.4.1 重组多肽CS5931的诱导表达40-41
• 3.2.4.2 可溶性表达情况检测41-42
• 3.2.5 表达条件的确定42
• 3.3 实验结果42-44
• 3.3.1 重组多肽CS5931-HIS的诱导表达情况42-43
• 3.3.2 重组多肽CS5931-HIS的表达形式分析43-44
• 3.3.3 重组多肽CS5931-HIS的表达条件44
• 3.4 分析和讨论44-46
• 第四章 抗肿瘤多肽CS5931的分离、纯化与冻干46-52
• 4.1 实验材料46-47
• 4.1.1 仪器和设备46-47
• 4.1.2 实验试剂47
• 4.1.3 相关溶液的配制47
• 4.2 实验方法47-50
• 4.2.1 重组蛋白在变性条件下的纯化47-48
• 4.2.2 重组蛋白CS5931-HIS的复性48
• 4.2.3 BCA法测定重组多肽的浓度48-49
• 4.2.4 MTT法测蛋白活性49
• 4.2.5 超声波破碎的时间确定49
• 4.2.6 镍离子亲和层析洗涤液和洗脱液中咪唑浓度的确定49-50
• 4.2.7 冻干方法的改善50
• 4.3 实验结果50-51
• 4.3.1 超声波破碎时间的选择50
• 4.3.2 镍离子亲和层析洗涤液和洗脱液中咪唑浓度的确定50-51
• 4.3.3 超滤离心浓缩蛋白溶液对冻干蛋白活性的影响51
• 4.4 分析和讨论51-52
• 结论52-53
• 参考文献53-56
• 第二篇 转基因棉花治理土壤重金属污染的研究56-104
• 摘要56-57
• ABSTRACT57-61
• 第一章 文献综述61-74
• 1.1 土壤重金属污染情况以及危害61-62
• 1.2 重金属污染土壤的治理方法62-64
• 1.3 转基因植物修复被污染的土壤的研究进展64-65
• 1.4 植物转基因的方法65-67
• 1.4.1 农杆菌介导法65-66
• 1.4.2 基因枪法66
• 1.4.3 花粉管导入法66-67
• 1.4.4 其他方法67
• 1.5 棉花植物组织培养现状67-72
• 1.5.1 体细胞胚胎发生67-71
• 1.5.1.1 影响体细胞胚胎发生的因素67-69
• 1.5.1.2 胚性愈伤组织的形成和培养69
• 1.5.1.3 体细胞胚的萌发和成熟69-71
• 1.5.2 器官发生71-72
• 1.6 课题的研究目的和意义72-74
• 第二章 含ACBP1基因质粒农杆菌的转化74-84
• 2.1 实验材料74-78
• 2.1.1 菌种及质粒74-75
• 2.1.2 仪器和设备75
• 2.1.3 实验试剂及溶液的配制75-77
• 2.1.3.1 实验试剂75-77
• 2.1.3.2 主要溶液的配制77
• 2.1.4 主要培养基成分和配制方法77-78
• 2.1.5 酶及引物78
• 2.2 实验方法78-81
• 2.2.1 质粒转化大肠杆菌78-79
• 2.2.2 质粒DNA的小量提取(质粒小提取试剂盒法)79-80
• 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳80
• 2.2.4 质粒转化农杆菌LBA440480-81
• 2.3 实验结果81-82
• 2.3.1 质粒的提取81
• 2.3.2 质粒转化大肠杆菌与农杆菌的卡那霉素抗性筛选81-82
• 2.3.3 质粒转化农杆菌LBA440482
• 2.3.3.1 琼脂糖凝胶电泳82
• 2.3.3.2 质粒DNA测序鉴定82
• 2.4 分析与讨论82-84
• 2.4.1 农杆菌转化系统的优点82-84
• 第三章 农杆菌介导ACBP1基因转化棉花84-100
• 3.1 实验材料85-88
• 3.1.1 外植体材料85
• 3.1.2 仪器及设备85
• 3.1.3 主要溶液的配制85-88
• 3.2 实验方法88-92
• 3.2.1 无菌苗的获得88
• 3.2.2 愈伤组织的诱导88-89
• 3.2.2.1 棉花品种的选择88
• 3.2.2.2 基础培养基种类对棉花愈伤诱导的影响88-89
• 3.2.2.3 激素的选择89
• 3.2.2.4 不同碳源对愈伤组织诱导的影响89
• 3.2.2.5 棉花愈伤组织的防褐化研究89
• 3.2.3 农杆菌介导的基因转化89-91
• 3.2.3.1 预培养对转化的影响90
• 3.2.3.2 农杆菌菌液浓度和浸染时间对出愈率的影响90
• 3.2.3.3 共培养时间对转化效率的影响90
• 3.2.3.4 愈伤组织的脱菌处理90-91
• 3.2.4 愈伤组织的生芽诱导91
• 3.2.4.1 培养基性质(液体、固体)对诱导生芽的影响91
• 3.2.4.2 碳源对诱导生芽的影响91
• 3.2.4.3 赤霉素对生芽的影响91
• 3.2.4.4 AC、AgNO_3的添加对生芽的影响91
• 3.2.5 生根诱导91-92
• 3.2.5.1 培养基性质对生根的影响91
• 3.2.5.2 不同碳源对生根的影响91
• 3.2.5.3 谷氨酰胺对生根的影响91-92
• 3.3 实验结果92-99
• 3.3.1 无菌苗的获得92-93
• 3.3.2 愈伤组织的诱导93-96
• 3.3.2.1 棉花品种的选择93-94
• 3.3.2.2 培养基的选择94
• 3.3.2.3 激素水平对愈伤组织诱导的影响94-95
• 3.3.2.4 棉花愈伤组织的防褐化研究95-96
• 3.3.3 农杆菌介导的基因转化96-98
• 3.3.3.1 预培养对共转化效率的影响96-97
• 3.3.3.2 菌液浓度和浸染时间对转化情况的影响97
• 3.3.3.3 共培养时间对愈伤组织的影响97
• 3.3.3.4 愈伤组织的脱菌处理97-98
• 3.3.4 愈伤组织的生芽诱导98
• 3.3.4.1 培养基性质对愈伤生芽的影响98
• 3.3.4.2 不同碳源对生芽的影响98
• 3.3.4.3 赤霉素对生芽的影响98
• 3.3.4.4 AC、AgNO_3的添加对生芽的影响98
• 3.3.5 生根诱导98-99
• 3.3.5.1 培养基性质对生根的影响98
• 3.3.5.2 不同碳源对生根的影响98-99
• 3.3.5.3 谷氨酰胺对生根的影响99
• 3.4 分析与讨论99-100
• 结论100-101
• 参考文献101-104
• 致谢104-105
• 攻读学位期间发表的学术论文目录105-106

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