基于肽段N端或组氨酸结合反应的蛋白质混合物简化策略

发布时间：2017-08-19 09:28

  本文关键词：基于肽段N端或组氨酸结合反应的蛋白质混合物简化策略

  更多相关文章： 蛋白质组学 质谱鉴定 低丰度蛋白质富集 高丰度蛋白质去除

【摘要】：复杂生物体系中的蛋白质以及因不同修饰而产生的蛋白质异构体的数量可达百万种。随着蛋白质组学研究的深入进展,这些动态范围过宽、理化性能差异过大的复杂蛋白质为探索生命活动的本质带来了巨大挑战。高丰度蛋白质因其表达水平高而容易被有效分离鉴定,与此相比中低丰度蛋白质由于本身数量庞大,组成复杂而不易被有效检测,在分离和鉴定过程中,高丰度蛋白质的强信号也会掩盖或结合大量的低丰度蛋白质,为中低丰度蛋白质的分离鉴定造成极大干扰。不仅是低丰度蛋白质,对于很多高丰度蛋白质的研究,同样面临质谱分析结果的序列覆盖率低,定量稳定性差等问题,这给蛋白质组研究中的分析鉴定方法学带来了巨大的挑战。针对此问题,科研人员从不同的角度入手提出解决方案。在蛋白质组的研究中,鸟枪法被广泛地应用于蛋白质检测。蛋白质混合物被酶解为肽段的混合物,然后利用质谱进行测序分析,计算机根据科研人员已经设定的计算法则,将实验谱图与理论谱图匹配,并找到鉴定肽段在蛋白质序列中的相应位置,从而确定该混合物中具体的蛋白质成分。鸟枪法的应用摆脱了传统凝胶分离技术中的限制与不足,同时也带来了相应的弊端。通过鸟枪法,混合溶液中不仅产生了易于质谱检测的高丰度肽段,也产生了难以检测到的低丰度肽段。所谓低丰度,并不意味着这些肽段含量非常低,它们可能仅仅是被数量巨大的高丰度肽段抑制,或者在质谱分析时,离子化效率偏低,由于质谱灵敏度的限制,在图谱采集时更容易被遗漏掉。但是,即便是因为各种原因,部分肽段的序列及其翻译后修饰变体,无法有效监测,并不意味着这些序列携带的信息不重要。相反,我们要发展相应的技术体系与方法,帮助发现这些遗漏的肽段或蛋白质。大量的研究结果表明,低丰度肽段、蛋白质,在生物界中往往携带着重要的信息或是发挥着不可取代的作用。经过多年来的研究表明,在疾病治疗方面,低丰度肽段或是蛋白质往往充当了诊断、预后和治疗效果的标记物,同时它们也可能是治疗的靶点。因此,对于高丰度蛋白质去除和低丰度蛋白质的富集、鉴定成为了具有重要意义的研究方向。要改善低丰度蛋白质的鉴定,一般通过三种机制:(1)消耗高丰度蛋白质;(2)富集低丰度蛋白质;(3)提高质谱对蛋白质的灵敏度与准确度。其中提高色谱、质谱的分离与分辨率成本高,且容易受到仪器本身的条件限制,因此,目前国际上对于中低丰度的分离与鉴定主要在富集低丰度蛋白质方面,例如抗体免疫去除;蛋白均衡器;修饰蛋白质、核酸结合蛋白质富集等,但是这些方法具有选择性,对于复杂样本的通用性较差。现在的问题是,我们缺乏通用性好的蛋白质复杂体系简化策略,因此该研究课题从两个方面展开:第一,利用氨基活性反应基团或羧基活性反应基团与化学基团的无差别反应,达到复杂系统中高丰度蛋白质或肽段的消减;第二,靶向富集含某种特定氨基酸的肽段,从而简化体系,降低基质效应。本论文共分为三个部分,第一章概述了蛋白质组研究中低丰度蛋白质的富集、鉴定技术,以及靶向富集含特定氨基酸肽段的意义、现状与研究进展,同时对目前国际上低丰度研究的常用方法,例如抗体免疫去除、蛋白均衡器、修饰蛋白质、核酸结合等进行了分析研究,在此基础上提出了本论文的研究内容与目标,即通用性强的高丰度蛋白质去除方法以及特异性肽段富集策略。在第二章,我们开展了通用性强的高丰度蛋白质去除方法的探究。在这一部分中,我们利用酶切后肽段末端氨基活性反应基团或羧基活性反应基团与活性试剂发生结合作用从而去除高丰度肽段,并进一步优化结合氨基或羧基的浓度速率关系实现研究目的。首先是对该实验的基础部分进行研究,我们考察了模型生物酵母细胞三种常用的不同方法,对比了它们的提取效率,提取方法的重复性考察,不同提取方法得到酵母蛋白质的丰度与其相对谱图数的线性关系的考察,可鉴定到的蛋白质丰富范围与理论值的比较。经过该部分实验,我们发现虽然NETN超声破碎法的提取效率最高,但经过FASP酶切处理,质谱分析的结果显示SDS碱裂解法与Urea超声破碎法鉴定到了蛋白质数量更多,其中SDS碱裂解法对肽段的修饰作用明显,因此Urea超声破碎法是理想的提取方法。在第二部分的研究中,我采用Urea超声破碎法进行酵母蛋白质提取。通过调研对比其他活性试剂,我选用了通用性强的CNBr活化琼脂糖珠作为肽段氨基端反应试剂,质谱分析结果显示经过多次结合后,部分肽段有损失,但是高丰度与低丰度之间拉平作用明显。在第三章中,由于随着高通量蛋白质组研究技术的发展,液相色谱-串联质谱被广泛的运用于深度地鉴定并定量分析目标肽段和蛋白质。但由于峰容量限制、基质效应等问题,在液相色谱-质谱(LC-MS)分析中,只能获得有效的蛋白质序列覆盖度,大量隐含肽段、色谱分离时的共洗脱肽段,严重影响以二级质谱为核心的定量方法的准确度。为了简化分析体系,提高质谱定量分析的准确度,本研究对含组氨酸肽段开展选择性富集方法的探索,建立组氨酸肽段与定量蛋白质组研究串联的分析方法。实验结果表明,Cu-beads与肽段反应30mins,肽段上样量与C u-beads比例为1:1(μg:ul)的情况下为最优条件,可以实现稳定性好,重现性高的his肽段选择性富集。在i TRAQ按比例标记试验中,含组氨酸肽段富集可以明显改善定量分析的准确度。因此,his肽段富集,可以作为一种简单、有效的复杂蛋白质组简化策略,并提高定量蛋白质组研究的准确性。
【关键词】：蛋白质组学 质谱鉴定 低丰度蛋白质富集 高丰度蛋白质去除
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R917
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 缩略词表10-11
• 第一章 前言11-17
• 1. 蛋白质的高分辨分离与质谱分析策略11-12
• 2. 低丰度蛋白质的选择性富集12-13
• 3. 高丰度蛋白质的去除13-14
• 4. 靶向氨基酸的目标肽段富集技术14
• 5. 本研究内容及意义14-17
• 第二章 通用性高丰度蛋白质消减策略及其基础研究17-29
• 1. 实验部分17-20
• 1.1 仪器与试剂17-18
• 1.2 试验方法18-20
• 1.2.1 SDS碱裂解法18
• 1.2.2 NETN超声破碎法18-19
• 1.2.3 UREA超声破碎法19
• 1.2.4 酵母蛋白FASP酶切19
• 1.2.5 CNBR活化琼脂糖珠与酵母蛋白酶切后肽段的结合19-20
• 1.2.6 LC-MS/MS分析20
• 1.2.7 数据分析20
• 2. 结果与讨论20-27
• 2.1 酵母蛋白不同提取方法考察20-24
• 2.1.1 三种提取方法的重现性考察20-21
• 2.1.2 三种提取方法的提取效率考察21-22
• 2.1.3 三种提取方法的质谱鉴定结果对比22
• 2.1.4 不同提取方法得到酵母蛋白的丰度与其相对谱图数的线性关系考察22-24
• 2.2 高丰度蛋白去除方法研究24-27
• 2.2.1 肽段与CNBR活化琼脂糖珠不同结合次数的质谱鉴定结果比较24-25
• 2.2.2 不同结合次数的样品其低丰度与高丰度蛋白的比例25-26
• 2.2.3 CNBR活化琼脂糖珠对N末端修饰肽段的富集26-27
• 3. 小结27-29
• 第三章 含组氨酸肽段的靶向富集对蛋白质组学定量准确度的影响探索29-39
• 1. 实验部分30-32
• 1.1 仪器与试剂30
• 1.2 试验方法30-32
• 1.2.1 UREA超声破碎法提取酵母蛋白31
• 1.2.2 小鼠肝蛋白的提取31
• 1.2.3 蛋白FASP酶切31
• 1.2.4 ITRAQ标记混合样品31-32
• 1.2.5 CU-BEADS结合实验32
• 1.2.6 LC-MS/MS分析32
• 1.2.7 数据分析32
• 2．结果与讨论32-38
• 2.1 铜珠的制备33
• 2.2 比较含有组氨酸肽段和铜珠的不同结合时间33-34
• 2.3 铜珠对含组氨酸肽段的结合性能34-35
• 2.4 含组氨酸肽段的富集在ITRAQ定量实验中的应用35-37
• 2.5 含组氨酸肽段的富集在HELA定性实验中的应用37-38
• 3．结论38-39
• 全文小结39-41
• 参考文献41-45
• 附录45-63
• 个人简历63-65
• 致谢65

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本文编号：699950