新人乳四糖LNnT及其衍生物的连续一锅多酶体系合成研究

发布时间：2017-08-19 15:39

本文关键词：新人乳四糖LNnT及其衍生物的连续一锅多酶体系合成研究

【摘要】：人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)是人类乳汁中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体成分。新人乳四糖lacto-N-neotetraose (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, LNnT)是人乳寡糖中十分重要的两个核心结构(lacto-N-tetraose,Galβ-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc,LNT和LNnT)之一,可以在不同位置发生不同程度的唾液酸化以及岩藻糖化,从而形成一系列结构复杂的人乳寡糖。到目前为止,已经有超过100多种LNnT结构被分离确证。有趣的是,与其他种类哺乳动物的寡糖相比,这些新人乳寡糖在组成以及复杂程度上,表现出明显地不同。大量研究表明,对于母乳喂养的婴儿,人乳寡糖发挥着十分广泛且有益的生物学作用。例如,促进肠道菌群中有益菌群的生长、防止病毒感染、阻碍病原体的黏附、调节肠道上皮细胞应答、免疫调节等。值得一提的是,到目前为止,包括新人乳四糖在内的人乳寡糖已经在临床实验中被应用到婴儿配方和食物添加剂中。另外,新人乳四糖及其唾液酸化和岩藻糖化衍生物作为O-聚糖和N-聚糖中十分常见的结构,在生命活动过程中起着调节细胞间黏附以及信息传递的作用。例如,路易斯X(Lewis x,Lex)以及唾液酸化路易斯x(sLewis x,sLex)结构作为选择素类的糖基配体在炎症反应中发挥着非常重要的作用。此外,一些新人乳四糖衍生物,如含有Lex结构的五糖和含有sLeX结构的六糖,在许多的肿瘤细胞中高表达,已经被作为理想的肿瘤相关糖抗原(tumor associated carbohydrate antigens, TACAs),用于发展基于肿瘤相关抗原的糖疫苗。近20年来,生物活性显著且结构复杂多样的新人乳四糖及其唾液酸化和岩藻糖化衍生物越来越多地吸引了糖化学家们的关注。多种化学合成以及酶法合成策略相继应用到新人乳四糖及其唾液酸化和岩藻糖化衍生物的合成中。例如,逐步缩合定向线性合成、自动化固相合成、“一锅法”合成等各具特色的化学合成、酶法合成、化学酶法合成以及全细胞发酵。然而,目前发展的化学合成策略往往需要繁琐的保护、脱保护操作和大量的分离纯化工作,导致总体合成收率较低；酶法合成方面,酶的来源以及酶严格的底物适应性限制了其在复杂寡糖大量合成中的应用；全细胞发酵由于产物寡糖难以纯化也并非是最佳的合成策略。因此,我们仍然迫切地需要发展一种具有实践意义的合成策略,用以快速、高效地制备新人乳四糖及其唾液酸化和岩藻糖化衍生物。针对这一挑战,本论文发展了连续一锅多酶(one-pot multienzyme,OPME)合成策略并成功应用于一系列复杂新人乳寡糖及其唾液酸化和岩藻糖化衍生物的合成,主要开展了以下几方面工作：(1)以乳糖为起始反应物,通过连续的两步一锅多酶糖苷化反应(OPME1,β1-3-N-乙酰氨基葡糖基化和OPME 2,β1-4-半乳糖基化)高效的获得了LNnT四糖。(2)以LNnT为糖骨架,通过α2-3-唾液酶转移酶催化的OPME3对其进行唾液酸化修饰,并通过α1-3-岩藻糖转移酶催化的OPME4对其进行岩藻糖化修饰。(3)仅仅通过改变一锅多酶体系的催化顺序,利用α2-6-液酶转移酶催化的OPME 5对LNnT中间半乳糖进行选择性唾液酸化。最终,完成了新人乳四糖化合物LNnT、其唾液酸化的化合物3"'-sLNnT、含有LeX结构的五糖LNFP-Ⅲ、含有sLeX结构的六糖3"'-sLNFP-Ⅲ和中间半乳糖选择性唾液酸化的新人乳四糖衍生物6'-sLNnT、DSLNnT和6'-sLNFP-Ⅲ的制备级合成。其中,化合物6'-sLNnT,DSLNnT和6'-sLNFP-Ⅲ为首次合成。本论文的主要创新点包括以下两个方面：(1)首次实现对新人乳四糖的中间半乳糖选择性唾液酸化衍生物的大量合成制备。(2)首次提出了仅通过改变一锅多酶体系的催化顺序进行寡糖的选择性合成。
【关键词】：新人乳四糖 人乳寡糖 糖苷化 糖基转移酶 一锅多酶体系
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914
【目录】：

摘要10-13
ABSTRACT13-16
符号说明16-18
第一章绪论18-44
1.1 糖生物学研究进展18-21
1.1.1 糖类结构的多样性18-19
1.1.2 糖类的生物学意义19-21
1.2 寡糖的制备21-30
1.2.1 多糖降解法21-22
1.2.2 化学法合成22-24
1.2.3 酶法合成24-29
1.2.4 化学酶法合成29-30
1.3 人乳寡糖的研究进展30-44
1.3.1 人乳寡糖简介30
1.3.2 人乳寡糖结构的多样性30-31
1.3.3 人乳寡糖的生物学意义31-36
1.3.4 人乳寡糖的合成研究进展36-44
第二章连续一锅多酶策略合成新人乳四糖及其衍生物44-61
2.1 课题的设计提出44-47
2.2 一锅多酶合成策略47-50
2.2.1 酶法合成LNnT及其衍生物所需要的关键酶47-48
2.2.2 一锅多酶体系48-50
2.3 连续一锅多酶法高效合成四糖LNnT,150-53
2.3.1 乳糖受体连接臂的引入51
2.3.2 一锅多酶法合成三糖Lc3,951-52
2.3.3 一锅双酶法合成四糖LNnT,152-53
2.4 一锅双酶法合成五糖3'''-sLNnT,253-54
2.5 一锅双酶法合成LNnT衍生物LNFP-Ⅲ,3和3'''-sLNFP-Ⅲ,454-55
2.6 一锅双酶法高效合成五糖6'-sLNnT,555-58
2.6.1 一锅双酶法合成四糖6'-sLc3,1056-57
2.6.2 一锅双酶法合成五糖6'-sLNnT,557-58
2.7 一锅双酶法合成六糖DSLNnT,658
2.8 一锅双酶法合成LNnT衍生物6'-sLNFP-Ⅲ,758-60
2.9 一锅双酶法合成LNnT衍生物DSLNFP-Ⅲ,1160-61
第三章总结与展望61-64
3.1 全文总结61-62
3.2 创新点62
3.3 展望62-64
第四章实验部分64-80
4.1 一般方法64-67
4.1.1 细菌的培养64-66
4.1.2 酶蛋白的分离纯化66-67
4.2 连续一锅双酶法合成LNnT及其唾液酸化、岩藻糖化的LNnT衍生物67-80
4.2.1 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcpProN_3,968-69
4.2.2 Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcβProN_3,169-70
4.2.3 Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcpProN_3, 270-71
4.2.4 Gal β1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcβProN_3,371-72
4.2.5 Neu5Acα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcβProN_3,472-73
4.2.6 GlcNAcβ1-3(Neu5Acα2-6)Galβ1-4GlcβProN_3,1073-75
4.2.7 Galβ1-4 GlcNAcβ1-3(Neu5Acα2-6)Galβ1-4GlcβProN_3, 575-76
4.2.8 Neu5Acα2-3Galβ1-4 GlcNAcβ1 -3(Neu5Acα2-6)Galβ1-4GlcβProN_3,676-77
4.2.9 Gal β1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3(Neu5Acα2-6)Galβ1-4GlcαProN_3, 777-79
4.2.10 Neu5Acα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3(Neu5Acα2-6)Galβ1-4GlcβPrpN_3,1179-80
附录80-108
参考文献108-116
致谢116-118
攻读学位期间发表的学术论文118-119
附件119