心脏特异性CYP2E1基因修饰小鼠在毒理学评价中的应用保健食品中含蒽醌类成分中药原料的安全性评价

发布时间：2017-08-19 22:05

  本文关键词：心脏特异性CYP2E1基因修饰小鼠在毒理学评价中的应用保健食品中含蒽醌类成分中药原料的安全性评价

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【摘要】：背景 药物的毒性反应是非临床安全性评价的主要研究内容,其中高达26%的毒性反应是心血管毒性。目前,外源性药物导致心脏毒性的作用机制主要有氧化应激反应、脂质过氧化反应和免疫炎症反应等。CYP2E1是机体参与内外源性物质催化作用的一类重要的氧化代谢酶,同时产生活性氧自由基(reactive oxygen free radi cal, ROS),引发氧化应激反应、炎症反应和细胞凋亡等过程,进而对机体产生毒性。人源化CYP2E1基因修饰小鼠,为研究人CYP2E1基因表达调控和功能提供了完整的生物遗传系统,国内外许多研究已将其应用于CYP2E1的代谢机制以及与CYP2E1基因有关的疾病如脂肪性肝病的病理机制研究中。本实验选用两种心脏特异性CYP2E1基因修饰小鼠(心脏特异性CYP2E1转基因小鼠,a-MHC CYP2E 1 transgenic mice, Tg(+)和心脏特异性CYP2E1基因沉默小鼠,a-MHC CYP2E1 silence mice, sTg(+)),来进行CYP2E1基因的特异性底物--对乙酰氨基酚以及具有潜在心脏毒性药物--西布曲明的毒性评价的初步探索,以期选择一种敏感性更高的基因修饰动物模型,为具有潜在心脏毒性药物的非临床安全性评价寻找一种更加快速、灵敏、准确的动物模型。方法(1)两种心脏特异性CYP2E1基因修饰小鼠(Tg(+)和sTg(+))的繁殖及鉴定：PCR鉴定心脏特异性CYP2E1基因修饰小鼠的基因型,分别筛选出Tg(+)和sTg(+)小鼠进行繁殖培育并用于本实验。(2)对乙酰氨基酚的急性毒性评价预试验：8周龄雄性Tg(+)型小鼠、sTg(+)型小鼠、野生型C57BL/6小鼠(WT),各50只,分别随机分成2组,每组10只,溶媒对照组(灌胃给予纯净饮用水)及1个实验组(300 mg/kg对乙酰氨基酚)。给药过程中进行一般症状观察；给药3d后取血并解剖取心脏、肝脏、肾脏,测定各组实验小鼠血生化心脏功能指标(乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB))、肝功能指标(丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬门氨基酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)),肾脏功能指标(尿素(UN)、肌酐(CREA)),以及血常规指标；测定心脏、肝脏、肾脏脏器系数结果；并进行病理组织学检查。(3)西布曲明毒性评价：8周龄雄性Tg(+)型小鼠、sTg(+)型小鼠、野生型C57BL/6小鼠(WT),各50只,分别随机分成5组,每组10只,溶媒对照组(灌胃给予纯净饮用水)及4个实验组(50、100、150、300 mg/kg西布曲明)。给药过程中进行一般症状观察以及存活率的测定；给药15d后取血并解剖取心脏、肝脏、肾脏,测定各组实验小鼠血生化心脏功能指标(乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB))、肝功能指标(丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬门氨基酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)),肾脏功能指标(尿素(UN)、肌酐(CREA)):测定各脏器系数结果；并进行病理组织学检查,以及用免疫组织化学方法观察心脏组织缝隙蛋白43(connexin 43, CX43)的表达情况。结果(1)对乙酰氨基酚的急性毒性预试验：1)血生化指标显示,Tg(+)和WT型小鼠给药组的肝功能指标(ALT、AST、 ALP)、心功能指标(CK、 LDH、 CK-MB)均不同程度地显著高于其溶媒对照组(P0.05或P0.01),其中WT型小鼠的肝功能指标(ALT、 AST、 ALP)升高程度最大(P0.01),而sTG(±)型小鼠的心功能指标(CK、 CK-MB)的数值却是降低的(P0.05)。2)病理组织学结果显示,Tg(+)、 sTg(+)和WT型三种小鼠的给药组均表现出肝脏病理变化。(2)西布曲明毒性评价：1)血生化指标显示,在给药剂量50 mg/kg和100 mg/kg时,Tg(+)型小鼠的心功能指标(CK、 LDH、 CK-MB)均显著高于WT型小鼠(P0.05或P0.01)：在给药剂量50、100和150 mg/kg时,Tg(+)型小鼠的心功能指标(CK、LDH、 CK-MB)均显著高于sTg(+)型小鼠(P0.05或P0.01)；而在给药剂量300 mg/kg时,Tg(±)型小鼠的心功能指标(CK、LDH、 CK-MB)均显著低于WT和sTg(+)型小鼠(P0.05或P0.01),且sTg(+)型小鼠减小的程度最小。2)病理组织学结果显示,Tg(+)和WT型小鼠各个给药组均表现出心脏损伤的迹象。3)免疫组织化学染色显示,随着给药剂量的加大,Tg(+)、 sTg(+)和WT型三种小鼠CX43在心肌细胞闰盘处的表达数量均逐渐下降,且染色颜色逐渐变浅；而CX43在心肌细胞闰盘处的表达数量下降程度和染色颜色变浅程度由高到低分别为,Tg(+)型小鼠,其次是WT型小鼠,sTg(+)型小鼠。结论Tg(+)型小鼠在评价药物潜在心脏毒性试验中可能比WT型小鼠具有更高的敏感性,而sTg(+)型小鼠则相反,可能是一个很好的心脏毒性保护模型。背景决明子(Cassiae Semen)为豆科植物或小决明的干燥成熟种子,是一味具有清热明目、利水通便等功效的中草药。现代医学研究表明,决明子具有降压、调脂、保肝等作用,常用于治疗高血脂、高血压、便秘等疾病,并被纳入卫生部颁布的“药食同源名单”中。决明子的主要成分是蒽醌类化合物(如大黄素、大黄酚、大黄酸等),其在表现出广泛药理作用的同时,也表现出多种毒副作用。为了研究中药决明子原料药的毒性,我们进行了大鼠经口灌胃给予不同剂量的决明子6个月及恢复期,观察出现毒性反应的靶器官,阐明长期食用决明子后是否存在肝毒性、肾毒性、肠毒性等安全性隐患。方法试验选用SPF级SD大鼠240只,雌雄各半。购入体重雄性：80-100g,雌性：80-100g。适应环境饲养6天后,按体重和性别随机分为4组：高(10g生药/kgBW)、中(2.2g生药/kgBW、低(0.5g生药/kgBW3个剂量组和一个对照组(纯水)。给药体积：1.0m1/100g。给药频率采用每周给药6天,每天给药1次,连续给药6个月。给药期间于每天上午和下午各观察一次动物的一般状态,定期进行体重和摄食量的测定,在给药第3、6个月,给药6个月后恢复4周,禁食12～1 6小时,分别剖杀20只/组,雌雄各半。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,从腹腔动脉采血进行血液学、血清生化学测定,剖检主要脏器进行脏器重量称量、计算脏器重量及脏器系数,并对各个剂量组全部脏器进行组织病理学检查。结果1、大鼠连续灌胃给予决明子三个月、六个月及其恢复期的试验周期中,各给药剂量组及对照组动物给药前、后一般状况观察未见异常,且未发生因给予决明子药物本身引起的大鼠濒死和死亡的毒性反应。2、各给药剂量组及对照组大鼠体重均增长,且(?)与(?)大鼠的增长速度分别依次为：CN组T1组T2组T3组,并呈现出一定的剂量-反应关系。3、与对照组相比,各给药剂量组6性大鼠网织红细胞百分比(RET%)以及总胆红素(TBIL)偏低,且恢复4周后,网织红细胞百分比(RET%)恢复正常,但T3组(?)大鼠的总胆红素(TBIL)依旧偏低。4、T2、T3组6性大鼠的肾脏系数均不同程度地显著性高于对照组(P0.05或P0.01)。5、连续灌胃决明子六个月后,在T1组和T2组剂量下大鼠未出现与供试品有关的毒理学改变,但在T3组剂量下可引起大鼠肾脏近曲小管上皮细胞内色素沉积,并可能引起肾小管萎缩及再生,且上述现象在恢复4周后虽有所缓解,但仍存在。结论在本试验室条件下,SD大鼠连续灌胃决明子六个月,在T3组剂量下出现毒性的靶器官是肾脏,而T1组和T2组未出现明显的毒性反应。
【关键词】：细胞色素P450 2E1 基因修饰 对乙酰氨基酚 西布曲明 药物毒性 决明子 冻干粉 蒽醌 长期毒性试验
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R994.4
【目录】：

• 第一部分 心脏特异性CYP2E1基因修饰小鼠在毒理学评价中的应用4-41
• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-8
• 前言8-14
• 材料和方法14-20
• 实验结果20-34
• 讨论34-36
• 结论36-37
• 参考文献37-41
• 第二部分 保健食品中含蒽醌类成分中药原料的安全性评价41-74
• 中文摘要41-42
• 英文摘要42-44
• 前言44-47
• 材料和方法47-51
• 实验结果51-71
• 讨论71-72
• 结论72-73
• 参考文献73-74
• 个人简历74-75
• 英文缩略表75-78
• 致谢78-79

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本文编号：703172