雷洛昔芬对镉染毒大鼠成骨细胞维生素D受体的影响
本文关键词：雷洛昔芬对镉染毒大鼠成骨细胞维生素D受体的影响
【摘要】：目的:本研究通过体外培养大鼠成骨细胞及建立镉染毒细胞模型,观察染镉及雷洛昔芬干预后成骨细胞的存活率以及雌激素受体α(Estrogen receptorα,ERα)和维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)在细胞中的表达,探讨雷洛昔芬(raloxifene,RAL)对镉染毒成骨细胞(osteoblast,OB)的作用及机制,为临床治疗慢性镉中毒所致骨损害提供新的方法。方法:选取出生不足24h的新生大鼠5只,通过胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,从颅顶骨中分离提取出成骨细胞,对所提取的成骨细胞进行细胞形态学鉴定。进行细胞原代培养和传代培养。所有实验检测均选用第4代细胞。用CCK-8法检测不同浓度镉染毒和雷洛昔芬干预后各组成骨细胞的存活率,选取适宜的镉和雷洛昔芬浓度进行后续实验。将成骨细胞分为对照组,氯化镉组及雷洛昔芬组。用Trizol法提取各组成骨细胞总RNA,逆转录成cDNA,RT-PCR技术扩增出目的片段,测定各组成骨细胞中ERα和VDR基因表达情况;提取细胞总蛋白,通过蛋白质印迹法检测镉染毒后以及雷洛昔芬干预后成骨细胞中VDR蛋白的表达情况。实验数据采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,以P㩳0.05为差异有统计学意义。结果:原代成骨细胞贴壁前呈均匀球形,约24h开始贴壁,48~96h完全贴壁,细胞呈长梭形或多角形,与其他文献报道一致;对照组成骨细胞形态正常,与培养皿底贴合紧密;氯化镉组细胞形态发生改变,与培养皿底贴合不紧密,约50%细胞死亡;与氯化镉组相比,雷洛昔芬组少数细胞发生形态改变,与培养皿底贴合较为紧密,约20%细胞死亡。CCK-8实验显示:与对照组相比,氯化镉组细胞活力明显下降(P㩳0.01),细胞存活率与镉浓度呈反比(24h:r=㧟0.956,P㩳0.01;48h:r=㧟0.992,P㩳0.01),1μmol/L CdCl2作用24h即可使成骨细胞存活率由100.00%下降至85.49%,8μmol/L CdCl2作用24h后,成骨细胞存活率下降至50.22%;与氯化镉组相比,雷洛昔芬组成骨细胞活力显著增加(P㩳0.01),细胞存活率与雷洛昔芬浓度呈正比(24h:r=0.877,P㩳0.01;48h:r=0.965,P㩳0.01),1mg/L RAL干预24h细胞存活率无明显改变,而8mg/L RAL干预24h后细胞存活率可高达152.67%。RT-PCR显示:与对照组相比,氯化镉组成骨细胞内ERα表达上调(P㩳0.05),VDR基因表达明显下降(P㩳0.05);而与氯化镉组相比,雷洛昔芬组成骨细胞内ERα表达下降(P㩳0.05),VDR基因表达显著增高(P㩳0.05)。蛋白印迹结果显示:与对照组相比,氯化镉组成骨细胞内VDR蛋白表达明显下降(P㩳0.05);与氯化镉组相比,雷洛昔芬组成骨细胞内VDR蛋白表达显著增高(P㩳0.05),结果与RT-PCR一致。结论:镉可以通过其类雌激素作用对成骨细胞产生直接毒性,其机制可能是通过与ERα结合下调成骨细胞内VDR的表达;而雷洛昔芬可以干预镉的类雌激素作用,通过拮抗镉下调成骨细胞内VDR的表达对镉染毒成骨细胞起保护作用,改善慢性镉中毒骨质疏松。
【关键词】：成骨细胞 维生素D受体 氯化镉 雷洛昔芬
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：
- 中文摘要4-6
- ABSTRACT6-9
- 英汉缩略词对照表9-11
- 前言11-13
- 1 材料与方法13-31
- 1.1 主要实验试剂及仪器13-19
- 1.2 实验方法19-30
- 1.3 统计学方法30-31
- 2 结果31-37
- 2.1 细胞形态学鉴定31
- 2.2 成骨细胞的一般情况31-32
- 2.3 CCK-8 测定成骨细胞活力32-34
- 2.4 RT-PCR检测三组细胞VDR基因的相对表达34-35
- 2.5 蛋白印迹法检测三组细胞VDR蛋白的相对表达35-37
- 3 讨论37-40
- 4 结论40-41
- 参考文献41-46
- 附录（综述）46-56
- 参考文献52-56
- 致谢56
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，本文编号：704311
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