环孢素诱导肝损伤患者血清脂质组学研究

发布时间：2017-08-29 23:24

  本文关键词：环孢素诱导肝损伤患者血清脂质组学研究

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【摘要】：目的：1.建立适用于人血清脂质组学研究的气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)方法。2.使用GC-MS法和LC-MS/MS法分别对环孢素诱导药物性肝损伤组(CILI组)和正常对照组(non-CILI组)的血清样本进行检测。3.采用NIST11和HMDB数据库对上述质谱图进行检索比对,鉴定血清中的脂质,以脂质/内标峰面积比作为相对定量指标。4.使用多维数据统计分析方法,进行组间判别模型的建立,寻找两组间差异性代谢脂质。通过使用Metabo Anlayst和KEGG进行在线分析,探索CILI的潜在生物标记物和相关代谢通路,以期对疾病的发病机制有进一步了解并实现其早期诊断和及时治疗。方法：1.样本使用正己烷提取,氮气吹干后复溶,选择VF-WAXms毛细管色谱柱(0.25mm×30m×0.25μm)在Agilent 7890A-5975C气相色谱质谱联用仪进行测定。载气(高纯氦气)压力为20 psi；程序升温：70℃,保持1min;以20℃/min升温至180℃；然后以6℃/min升温至230℃,保持20min。进样量：1μL,分流比：50：1。质谱进样口温度：250℃；接口温度：270℃；离子源温度：230℃；电离电压：70 eV；四极杆温度：150℃；载气：高纯氦气,1.0 mL/min;选择全扫描模式,30-450m/z。2.样本使用二氯甲烷-甲醇-水三相(v/v/v=1：2：1)提取,氮气吹干后复溶,选择JADE-PAK二醇基色谱柱(250 mm×4.6 mm×5μm)在Agilent 1200-6410液相色谱串联质谱仪进行测定。流动相A：20%异丙醇-20mM甲酸铵,流动相B：20%异丙醇-80%乙腈。流速为0.3mL/min,梯度洗脱：0-2 min,92%B; 2-6 min, 86%B; 6-12 min,80%B; 12-18 min,75%B; 18-24min,65%B; 24-30min, 92%B; 31-45 min,92%B。在线脱气；柱温30℃；进样量20μL。离子源为ESI,选用正离子模式检测；干燥气(N2)流速为10.0 L/min,干燥气压力为40 psi,干燥气温度为325℃,毛细管电压为4000V。选择全扫描模式(SCAN), m/z范围：200-1300。3. GC-MS图谱使用MSD化学工作站软件自带的NIST11数据库进行自动检索匹配,定义相似度大于80%且保留时间漂移小于0.5min的组分为可靠结果。HPLC-MS/MS图谱的解析采用HMDB数据库进行精确分子量检索,定义质量数差异小于0.5 Da且保留时间漂移小于0.5min的组分为可靠结果。4.使用内标峰面积校正GC-MS和HPLC-MS/MS峰面积数据,进行多维数据统计分析,包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。通过PCA法对数据整体进行降维处理,实现组间分离。通过独立监督判别模型PLS-DA,进行组件判别,寻找差异性代谢脂质。最后建立双独立监督的OPLS-DA模型,排除其他干扰因素,选择VIP值1且曼-惠特尼U检验中P值0.05的组分,定义为两组间的差异性代谢脂质。使用LIPDMAPS数据库对差异性脂质进行进一步结构鉴定。导入Metabo Analyst网站进行代谢通路分析,定义得分大于0.01的为CILI相关代谢通路。结合差异性代谢物和相关通路对CILI的作用机制和潜在生物标记物进行分析探讨。结果：本课题共入组103个受试者,根据CIOMS标准分为CILI组(n=43)和non-CILI组(n=60)。通过建立人血清的GC-MS和HPLC-MS/MS检测方法,对血清中的脂质进行了分析,该方法分离度和重现性良好,适用于脂质组学的研究。通过检索比对并限定保留时间漂移后,能够对75种脂质代谢物进行检测。其中14种由GC-MS图谱分析获得,61种由HPLC-MS/MS图谱分析获得。样本数据使用PCA、PLS-DA和OPLS-DA模型进行多元数据统计分析。选择VIP值1且P值0.05的脂质组分,最终确定23种脂质,包括5种脂肪酸(FA)、8种磷脂酰胆碱(PC)、3种磷脂酰乙醇胺(PE)和6种鞘磷脂(SM)和1种胆固醇酯,为CILI组与non-CILI组的差异性脂质。导入Metabo Analyst网站进行通路分析,获得4条相关代谢通路：甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、脂肪酸代谢和鞘脂代谢,相关性得分分别为0.23,0.22,0.05和0.03。结论：本课题通过建立人血清脂质组学的GC-MS和HPLC-MS/MS方法,应用多维数据统计分析方法和代谢通路分析,对CILI组与non-CILI组的血清脂质代谢物进行了研究。获得与CILI发生密切相关的23种差异性脂质代谢物和4条相关脂质代谢通路。研究发现,CILI组的血清中的PC/PE水平有所降低,FA、SM和AA水平有所升高。这些脂质变化可能与脂质蓄积以及肝细胞膜的完整性损伤有关。这些研究结果有助于进一步了解CILI的作用机制并探索其生物标记物。
【关键词】：环孢素 药物性肝损伤 脂质组学 GC-MS HPLC-MS/MS
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R969
【目录】：

• 中文摘要10-13
• 英文摘要13-16
• 缩略语说明16-20
• 第一章 前言20-32
• 1 脂质组学概述20-28
• 1.1 脂质的分类20
• 1.2 脂质的生化过程20-22
• 1.3 脂质组学分析方法22-24
• 1.4 脂质组学数据库24-26
• 1.5 脂质组学数据处理方法26-27
• 1.6 脂质组学应用27-28
• 2 药物性肝损伤与环孢素28-30
• 3 研究意义和主要内容30-32
• 3.1 研究意义30
• 3.2 研究内容30-32
• 第二章 人血清脂质组学的GC-MS方法建立32-40
• 1 前言32
• 2 实验部分32-34
• 2.1 药品与试剂32
• 2.2 标准溶液配制32-33
• 2.3 样本前处理33
• 2.4 实验仪器及实验条件33-34
• 3 结果与讨论34-39
• 3.1 样品前处理方法优化34-36
• 3.2 仪器条件优化36
• 3.3 血清脂质组GC-MS图谱的结构鉴定36-39
• 4 结论39-40
• 第三章 人血清脂质组学的HPLC-MS/MS方法建立40-48
• 1 前言40
• 2 实验部分40-42
• 2.1 药品与试剂40-41
• 2.2 标准溶液制备41
• 2.3 样本前处理41
• 2.4 实验仪器及实验条件41-42
• 3 结果与讨论42-47
• 3.1 样品前处理方法优化42
• 3.2 仪器条件优化42-43
• 3.3 清脂质组HPLC-MS/MS图谱的结构鉴定43-47
• 4 结论47-48
• 第四章 基于GC-MS和HPLC-MS/MS方法对环孢素诱导肝损伤患者血清脂质进行研究48-70
• 1 前言48-49
• 2 实验部分49-51
• 2.1 受试者49
• 2.2 样本采集49
• 2.3 样本前处理49-50
• 2.4 实验仪器与条件50-51
• 2.5 数据统计方法51
• 3 结果51-61
• 3.1 GC-MS和HPLC-MS/MS分析52-53
• 3.2 潜在生物标记物分析53-60
• 3.3 相关代谢通路分析60-61
• 4 讨论61-69
• 4.1 甘油磷脂代谢62-64
• 4.2 花生四烯酸代谢64-65
• 4.3 脂肪酸代谢65-67
• 4.4 鞘脂代谢67-68
• 4.5 特例68-69
• 5 结论69-70
• 第五章 总结70-72
• 参考文献72-83
• 致谢83-84
• 攻读学位期间发表的学术论文84-85
• 学位论文评阅及答辩情况表85

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本文编号：756011