一种非病毒siRNA载体材料的制备与性能研究

发布时间：2017-08-30 13:22

  本文关键词：一种非病毒siRNA载体材料的制备与性能研究

  更多相关文章： siRNA递送 层层自组装 壳聚糖-siRNA-透明质酸(CHS-siRNA-HA)多层薄膜 基因沉默效应

【摘要】：研究背景：当下,如何改善siRNA药物在人体内的稳定性、提高它的靶向性,如何促进其通过细胞内吞作用被靶细胞摄取,如何开发siRNA的局部给药方式,克服全身给药带来的siRNA用量大效率低等问题,成为siRNA给药领域里一个个急待克服的难题。目的：制备一种能有效装载和保护siRNA药物的壳聚糖-siRNA-透明质酸(CHS-siRNA-HA)多层薄膜非病毒载体,探究该药物载体薄膜在溶液中的稳定性,并对其基因沉默效应做出评价。方法：利用层层自组装(Layer-by-layer self-assembly, LBL)技术,制备了CHS-siRNA-HA多层薄膜。通过UV-vis吸光度法,对组装过程中条件的优化、siRNA在薄膜上的生长过程,以及多层薄膜中的siRNA在不同缓释液中(NaCl溶液、PBS溶液和纯水溶液)的释放情况,分别进行了分析验证。用FTIR光谱法和13C-NMR波谱法,对CHS-siRNA-HA多层薄膜的组装过程从分子结构的角度进行了表征,对多层薄膜中高分子多聚物结合的作用机理,进行了初步探讨。用原子力显微镜(AFM)观察薄膜表面的形貌特征。结合UV-vis吸光度法和聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE),对薄膜在缓释液中的稳定性和siRNA序列的完整性,进行了评价。结合结合荧光图像和流式细胞术,采用直接与细胞接触的方式,对该siRNA载体薄膜的王IEK 293T细胞转染效应,进行了检测和评价。结果：(1) UV-vis法证明：第一、CHS-siRNA-HA多层薄膜在260nm处有很强的吸收峰,而且随着含siRNA的组装层数增加,在260 nm的吸光度值越大,由此验证了siRNA在CHS-siRNA-HA多层薄膜上的生长过程；第二,CHS-siRNA-HA多层薄膜的制备过程,与组装基底(石英片)的是否干燥和高分子多聚物溶液的是否过滤密切相关,基底不干燥和对溶液过滤处理,都会减少多层薄膜上siRNA的吸附量大小；第三,盐离子浓度是影响本实验中LBL制备的CHS-HA-siRNA多层薄膜崩解的重要因素,且盐离子浓度小于1M时,多层薄膜崩解程度随盐离子浓度增加而增加。过低或者过高的盐离子浓度对促进薄膜的崩解没有优势；第四,该siRNA载体薄膜在盐离子1 M NaCl溶液中释放效果最好,在pH 7.4的PBS缓冲液中次之,在纯水中稳定性最好。(2) FTIR光谱法和13C-NMR波谱法则证明：CHS分子在氨基部位(-NH2)有交联产生,另外HA的羟基(-OH)也参与了反应过程,除了有静电相互作用,可能还有其他的氢键相互作用。AFM测试结果表明,所有的薄膜的表面都不平整,加了siRNA以后,其薄膜表面整体上呈现明显突起的山丘状,另外产生了一些粒径较小的颗粒状物质。(3) UV-vis法,结合聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)实验,则证明了CHS-siRNA-HA多层组装薄膜在1 M NaCl溶液中孵育大约6天经后,siRNA几乎完全从膜上崩解脱落,但是缓释液中没有游离的裸siRNA出现,较好的验证了(CHS/HA)4(CHS/HA-siRNA)9多层薄膜释放出siRNA的稳定性；而孵育10 d后得到的缓释液,与HA-siRNA混合溶液,在相同位置出现了单一条带,由此则较好的验证了(CHS/HA)4(CHS/HA-siRNA)9多层薄膜释放出siRNA序列的完整性。(4) OLYMPUS荧光显微镜图像和BD FACSCALIBUR流式细胞仪统计结果均显示,第一,阳性对照组2-eGFP-siRNA(组装2层eGFP-siRNA的膜)和7-eGFP-siRNA(组装7层eGFP-siRNA的膜),均发生了明显的沉默绿色荧光蛋白的效应,说明我们的eGFP-siRNA从薄膜中释放出来了,并发挥了其基因沉默效应；第二,随着细胞HEK 293T转染过程的时间累积(1-3 d),2-eGFP-siRNA组的沉默绿色荧光蛋白基因的效果更明显,说明基因沉默效应与细胞转染时间有关；第三,在细胞培养2d的转染时间,7-eGFP-siRNA组的沉默绿色荧光蛋白基因的能力强于2-eGFP-siRNA组,说明基因沉默效应与组装的eGFP-siRNA层数多少有关。结论：成功构建了一种非病毒siRNA递送载体系统,为未来实现siRNA局部给药开辟了一条可行的途径。
【关键词】：siRNA递送 层层自组装 壳聚糖-siRNA-透明质酸(CHS-siRNA-HA)多层薄膜 基因沉默效应
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 内容摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 绪论13-28
• 1.1 层层自组装技术与生物超薄膜筑建概论13-15
• 1.1.1 层层自组装技术制备生物超薄膜13
• 1.1.2 多层生物薄膜的表征手段13-15
• 1.2 siRNA的研究现状15-26
• 1.2.1 RNA干扰(RNAi)技术15-17
• 1.2.2 siRNA药物的临床最新进展17-19
• 1.2.3 siRNA体内递送的障碍19-20
• 1.2.4 非病毒siRNA载体应具备的性质20
• 1.2.5 常用非病毒siRNA药物载体的研究现状20-26
• 1.3 本课题研究目的和意义、研究内容26-28
• 1.3.1 本课题的目的及意义26-27
• 1.3.2 本课题的研究内容27-28
• 第二章 壳聚糖-siRNA-透明质酸LBL薄膜的制备及表征28-43
• 2.1 实验原料与器材28-30
• 2.1.1 实验原料28
• 2.1.2 实验器材28-29
• 2.1.3 相关溶液的配制29-30
• 2.2 实验方法30-33
• 2.2.1 壳聚糖-siRNA-透明质酸LBL超薄膜的制备30-31
• 2.2.2 多层薄膜组装过程的验证31
• 2.2.3 多层薄膜制备的影响因素探讨31-32
• 2.2.4 多层薄膜的结构和形貌表征32-33
• 2.3 实验结果与分析33-42
• 2.3.1 UV-vis吸收光谱分析33-36
• 2.3.2 FTIR光谱分析36-39
• 2.3.3 ~(13)C-NMR波谱分析39-41
• 2.3.4 原子力显微镜测试(AFM)41-42
• 2.4 实验小结42-43
• 第三章 壳聚糖-siRNA-透明质酸LBL薄膜的缓释性能43-50
• 3.1 实验试剂与器材43-44
• 3.1.1 实验试剂43-44
• 3.1.2 实验器材44
• 3.2 实验方法44-46
• 3.2.1 siRNA多层薄膜在不同溶液中的缓释性能探索44
• 3.2.2 多层薄膜释放siRNA的基因完整性验证44-46
• 3.3 实验结果及分析46-49
• 3.3.1 UV-vis验证薄膜中siRNA药物的释放46-48
• 3.3.2 聚丙烯酰胺电泳实验验证释放siRNA基因的完整性48-49
• 3.4 本章小结49-50
• 第四章 壳聚糖-siRNA-透明质酸薄膜的基因沉默效应评价50-56
• 4.1 材料与方法50-52
• 4.1.1 细胞培养50-51
• 4.1.2 细胞转染51-52
• 4.2 试验结果与分析52-55
• 4.2.1 多层薄膜的基因沉默效应分析52-54
• 4.2.2 统计结果54-55
• 4.3 实验小结55-56
• 第五章 全文总结与展望56-59
• 5.1 结论56-57
• 5.1.1 壳聚糖-siRNA-透明质酸LBL薄膜的制备及表征56
• 5.1.2 壳聚糖-siRNA-透明质酸LBL薄膜的缓释性能探索56-57
• 5.1.3 壳聚糖-siRNA-透明质酸LBL薄膜的基因沉默效应评价57
• 5.2 论文创新点及进一步拓展57-59
• 缩略词59-60
• 参考文献60-68
• 致谢68-69
• 研究生在读期间发表与撰写的论文69
• 申请的专利69

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