负载siRNA的适配子修饰脂质—聚合物复合纳米粒的肺肿瘤靶向给药系统研究

发布时间：2017-09-06 10:00

  本文关键词：负载siRNA的适配子修饰脂质—聚合物复合纳米粒的肺肿瘤靶向给药系统研究

  更多相关文章： survivin siRNA AS1411 脂质复合纳米粒 肺部给药 原位肺癌模型

【摘要】：目的:制备适配子修饰脂质-聚合物复合纳米粒的肺肿瘤靶向给药系统,研究对survivin siRNA的负载与传递能力,并对其安全性和有效性进行体内外评价。方法:利用开环反应合成荷正电的类脂质材料环氧烷胺衍生物(EAAD,Epoxy Alkyl Amine Derivative),并通过1H-NMR和FTIR进行表征。用纳米沉淀法制备负载siRNA的适配子修饰脂质-聚合物复合纳米粒(AS1411-LHNPs),测定其粒径、Zeta电位、siRNA的抗血清降解能力与体外释放等。采用喷雾冷冻干燥法制备AS1411-LHNPs的干粉吸入剂,并进行制剂学评价。其次,利用MTT法、流式细胞仪(FCM)和激光共聚焦显微镜(CLSM)考察载体的细胞毒性及其对细胞摄取、胞内分布、细胞周期与凋亡的影响。通过目标基因及蛋白表达水平,考察survivin siRNA-AS1411-LHNPs对靶基因的沉默效果。以顺铂(DDP)为模型药物,考察survivin siRNA-AS1411-LHNPs对DDP的A549细胞抑制作用的影响。然后,利用Luciferase转染的人源性肺腺癌细胞株(Luc-A549)建立裸鼠原位肺癌模型,小动物活体成像仪考察尾静脉注射与肺部吸入给药对Cy5-siRNA-AS1411-LHNPs的裸鼠体内分布影响。最后,通过小动物成像和CT考察survivin siRNA-AS1411-LHNPs与DDP联和应用对肿瘤的抑制效果,并利用HE染色研究裸鼠各器官组织的变化。结果:1H-NMR和FT-IR验证了EAAD的结构,其纯度约为93%。AS1411-LHNPs的粒径为(73.0±3.8)nm,且外形圆整、粒径均一,Zeta电位为(-5.9±0.6)mV,且能有效提高siRNA在血清中的稳定性,并在pH 7.4的PBS介质中缓慢释放。喷雾冷冻干燥法制得LHNPs的干粉吸入剂,其空气动力学粒径为2.8μm左右,排空率大于90%,略有引湿性,能够满足肺部给药系统的要求。MTT结果显示,LHNPs安全性良好。细胞摄取与胞内定位实验结果表明,AS1411-LHNPs在A549细胞的摄取高达92%,且主要定位于细胞质中。AS1411-LHNPs在A549-RAW264.7共培养体系中可避开RAW264.7的摄取,有选择性的被A549细胞摄取。RT-PCR和Western Blot结果显示,survivin siRNA-S1411-LHNPs显著下调靶基因mRNA与蛋白的表达,且与Lipofectamine 2000相比具有长效作用。细胞周期和细胞凋亡实验结果表明,与对照组相比,survivin siRNA-AS1411-LHNPs可显著延长A549细胞的G2期并促进其凋亡。联合使用survivin siRNA-AS1411-LHNPs和DDP,可显著降低顺铂对A549细胞的IC50值,提高A549细胞对顺铂的敏感性,且存在一定的协同作用。Cy5-siRNA-AS1411-LHNPs经肺部吸入后,能提高肺部的局部药物浓度,并延长药物滞留时间。体内抑瘤实验和HE染色结果表明,联合使用survivin siRNA-AS1411-LHNPs与DDP能明显抑制肺肿瘤的生长,且能减少对DDP对正常组织的损伤。结论:本文成功构建了负载survivin siRNA的AS1411修饰脂质复合纳米粒肺部给药系统,可有效递送基因药物,并下调相关基因及蛋白的表达。联合使用survivin siRNA-AS1411-LHNPs和DDP,能显著提高肿瘤细胞对DDP的敏感性,增强其抗肿瘤效果。
【关键词】：survivin siRNA AS1411 脂质复合纳米粒 肺部给药 原位肺癌模型
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文献综述12-20
• 1 siRNA逆转肿瘤细胞的多药耐药12-13
• 1.1 siRNA12-13
• 1.2 survivin siRNA13
• 2 siRNA给药系统的选择13-15
• 2.1 给药系统的选择13-14
• 2.2 提高靶向性14-15
• 3 siRNA肺部给药的优势15-16
• 4 展望16
• 5 本研究的意义和目的16-20
• 第二章 类脂质材料的合成及表征20-25
• 1 实验材料和仪器20
• 1.1 实验材料20
• 1.2 实验仪器20
• 2 实验方法20-21
• 2.1 EAAD的合成20-21
• 2.2 DSPE-PEG2000-Mal的合成21
• 3 实验结果21-24
• 3.1 EAAD的表征21-23
• 3.2 DSPE-PEG2000-Mal的表征23-24
• 4 本章小结24-25
• 第三章 AS1411-LHNPs的制备及评价25-39
• 1 实验材料和仪器25-26
• 1.1 实验材料25
• 1.2 实验仪器25-26
• 2 实验方法26-31
• 2.1 负载siRNA的脂质复合纳米粒（LHNPs）的制备26-27
• 2.2 包封率和载药量的测定27
• 2.3 AS1411靶向脂质复合纳米粒（AS1411-LHNPs）的制备27-28
• 2.4 AS1411-LHNPs的表征28-29
• 2.5 体外释放29
• 2.6 干粉吸入剂的制备29-30
• 2.7 干粉吸入剂理化性质的评价30-31
• 3 实验结果31-38
• 3.1 LHNPs制备处方的优化31-32
• 3.2 包封率和载药量的测定32-33
• 3.3 AS1411修饰的LHNPs的制备33-34
• 3.4 AS1411-LHNPs的制备及形态表征34-35
• 3.5 血清稳定性考察35-36
• 3.6 体外释放研究36-37
• 3.7 干粉吸入剂理化性质的评价37-38
• 4 本章小结38-39
• 第四章 AS1411-LHNPs细胞学评价39-63
• 1 实验材料和仪器39-40
• 1.1 实验材料39
• 1.2 实验仪器39-40
• 2 实验方法40-46
• 2.1 LHNPs安全性的考察40
• 2.2 转染时间对LHNPs的A549细胞摄取的影响40-41
• 2.3 FCM考察AS1411-LHNPs的A549细胞摄取41
• 2.4 CLSM考察AS1411-LHNPs在A549细胞中的分布41
• 2.5 AS1411-LHNPs在A549-RAW 264.7 共培养体系中的分布41-42
• 2.6 Western Blot法筛选高沉默效率survivin siRNA链42-43
• 2.7 RT-PCR考察survivin基因mRNA水平的表达43-44
• 2.8 A549细胞中survivin蛋白表达44
• 2.9 survivin siRNA对A549细胞凋亡的影响44
• 2.10 survivin siRNA对A549细胞周期的影响44-45
• 2.11 体外药效学研究45-46
• 2.12 数据分析46
• 3 实验结果46-61
• 3.1 LHNPs安全性的评价46
• 3.2 转染时间对细胞摄取的影响46-48
• 3.3 AS1411-LHNPs在A549中的摄取48-49
• 3.4 AS1411-LHNPs在A549细胞中的分布49-50
• 3.5 AS1411-LHNPs在A549-RAW 264.7 共培养体系中的分布50-52
• 3.6 Western Blot法筛选高沉默效率survivin siRNA链52-53
• 3.7 RT-PCR考察survivin基因mRNA水平的表达53-54
• 3.8 A549细胞中survivin蛋白表达54-56
• 3.9 survivin siRNA-AS1411-LHNPs对A549细胞凋亡的影响56-58
• 3.10 survivin siRNA-AS1411-LHNPs对A549细胞周期的影响58-59
• 3.11 体外药效59-61
• 4 本章小结61-63
• 第五章 AS1411-LHNPs体内组织分布及药效学评价63-74
• 1 实验材料和仪器63
• 1.1 实验材料63
• 1.2 实验仪器63
• 2 实验方法63-65
• 2.1 实验动物63
• 2.2 溶液配制63-64
• 2.3 肺癌原位模型的建立64
• 2.4 体内组织分布64
• 2.5 药效学评价64-65
• 2.6 评价指标65
• 2.7 统计学分析65
• 3 实验结果65-73
• 3.1 体内组织分布65-68
• 3.2 药效学评价68-73
• 4 本章小结73-74
• 全文总结74-75
• 参考文献75-80
• 硕士学位期间科研成果80-81
• 致谢81-82

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本文编号：802454