精氨酸脱亚胺酶位点突变对聚乙二醇修饰的影响研究

发布时间：2017-09-06 16:14

  本文关键词：精氨酸脱亚胺酶位点突变对聚乙二醇修饰的影响研究

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【摘要】：研究目的:对野生型ADI(wADI)进行定点突变改造,构建突变型ADI(mADI)大肠杆菌重组表达系统,筛选出高表达的重组工程菌。建立重组mADI的发酵工艺和纯化工艺。对比分析位点突变对酶活性的影响。对野生型和突变型ADI进行PEG修饰和纯化,对比分析位点突变对PEG修饰ADI的影响。研究方法:(1)ADI突变位点的设计与构建表达(1)根据支原体来源的野生型ADI蛋白序列设计大肠杆菌密码偏爱性的突变型ADI基因序列并对其全基因合成。将全基因合成的mADI插入到pET-3a,构建重组质粒pET-3a-mADI。(2)重组质粒pET-3a-mADI转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3),采用抗性筛选法获得重组工程菌。(3)摇瓶表达筛选高表达菌株并进行30L体系放大发酵表达。(2)ADI的纯化工艺和酶活性研究:(1)通过高压匀浆法破菌、包涵体洗涤、稀释复性、DEAE阴离子交换层析、Butyl疏水层析等工艺获得纯的目的蛋白。(2)对纯化后的wADI和mADI分别进行紫外法测活,对比分析位点突变对酶活性的影响。(3)ADI的PEG修饰研究:(1)采用PEG-5k对两种酶进行不同比例的修饰。(2)采用分子筛法对修饰后的样品进行纯化,获得高纯度的修饰样品。(3)采用SEC-HPLC/UV-RI紫外示差联用法测定平均修饰度,体外测活法对修饰样品测活,对比分析位点突变对PEG修饰ADI的影响。结论:经双酶切和基因测序法对构建的重组质粒进行检测,成功构建了重组表达质粒pET-3a-mADI,目的基因在大肠杆菌中以包涵体形式表达,表达量高达30%。建立并确定了mADI的摇瓶表达和发酵罐放大培养条件。探索并建立了稳定的纯化工艺,SDS-PAGE和HPLC纯度都高于95%以上。经体外测活对比分析,突变位点未对酶活性产生明显的影响。成功实现wADI和mADI不同摩尔比例的PEG修饰,并通过纯化获得各自单一的修饰产物。对比分析这两种酶进行PEG修饰前后的差异和相关性(PEG修饰个数的差异,修饰位点的差异、酶活性差异等),证明了突变位点会影响PEG与精氨酸脱亚胺酶结合,在wADI相应的位点极易被PEG修饰,而经过突变后该位点不能够被PEG修饰,在相同修饰比例下突变型精氨酸脱亚胺酶(mADI)平均修饰度均比野生型精氨酸脱亚胺酶(wADI)平均修饰度少1个,最终在酶活性上存在差异,不论相同比例下获得的修饰产物,还是不同修饰比例获得相同修饰个数得产物,突变后的PEG-mADI(m ADI)酶活均高于野生型PEG-wADI(wADI)。这为后期开发低免疫原性,高活性的精氨酸脱亚胺酶奠定了理论和实践基础。
【关键词】：精氨酸脱亚胺酶 突变 纯化 聚乙二醇 酶活
【学位授予单位】：重庆理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 英文缩略表12-14
• 1 绪论14-25
• 1.1 精氨酸脱亚胺酶简介14-17
• 1.1.1 ADI的来源及性质14-15
• 1.1.2 ADI的用途15-17
• 1.1.2.1 ADI具有抗癌潜力15-17
• 1.1.2.2 ADI具有预防龋齿的作用17
• 1.1.2.3 ADI用于生产L-瓜氨酸17
• 1.2 精氨酸脱亚胺酶研究进展17-20
• 1.2.1 ADI抗肿瘤研究进展17-18
• 1.2.2 ADI的突变研究18-20
• 1.3 聚乙二醇修饰蛋白技术20-23
• 1.3.1 聚乙二醇修饰方法简介20-21
• 1.3.2 聚乙二醇修饰精氨酸脱亚胺酶的研究概况21-23
• 1.4 本课题研究目的23
• 1.5 研究内容和技术路线23-25
• 1.5.1 研究内容23-24
• 1.5.2 技术路线24-25
• 2 精氨酸脱亚胺酶突变位点的设计与构建表达25-40
• 2.1 材料25-29
• 2.1.1 主要试剂和耗材25-26
• 2.1.2 基本溶液的配制26-27
• 2.1.3 菌株和质粒27-28
• 2.1.4 主要仪器28-29
• 2.2 实验方法29-36
• 2.2.1 目的基因的获得29
• 2.2.2 重组质粒pET3a-wADI/mADI的构建及鉴定29-33
• 2.2.2.1 载体酶切和胶回收30-31
• 2.2.2.2 连接反应31
• 2.2.2.3 感受态细胞（DH5α）制备31
• 2.2.2.4 连接产物转化31-32
• 2.2.2.5 重组质粒筛选及鉴定32-33
• 2.2.3 重组质粒pET3a-wADI/mADI表达33-36
• 2.2.3.1 表达感受态细胞制备33-34
• 2.2.3.2 重组质粒pET3a-wADI/mADI的转化及筛选34
• 2.2.3.3 重组wADI/mADI蛋白摇瓶表达34
• 2.2.3.4 SDS-PAGE检测表达蛋白34-35
• 2.2.3.5 放大培养发酵35-36
• 2.3 结果与分析36-38
• 2.3.1 重组质粒pET3a-wADI/mADI的构建及鉴定36-37
• 2.3.2 重组质粒pET3a-wADI/mADI表达37-38
• 2.4 小结38-40
• 3 突变型精氨酸脱亚胺酶纯化与性质研究40-53
• 3.1 引言40
• 3.2 材料40-42
• 3.2.1 主要试剂40-41
• 3.2.2 主要设备和仪器41
• 3.2.3 主要缓冲配制41-42
• 3.3 包涵体前处理研究42-43
• 3.3.1 高压匀浆破菌研究42-43
• 3.3.2 包涵体洗涤研究43
• 3.3.3 变性和复姓研究43
• 3.4 重组ADI蛋白的纯化研究43-45
• 3.4.1 DEAE柱层析纯化43-44
• 3.4.2 Butyl柱层析纯化44-45
• 3.5 突变体ADI蛋白性质对比研究45-47
• 3.5.1 纯度检测45-46
• 3.5.2 Lowry法测定蛋白浓度46
• 3.5.3 酶活测定46-47
• 3.6 结果与讨论47-51
• 3.6.1 包涵体前处理结果和分析47-48
• 3.6.2 重组ADI蛋白的纯化结果和分析48-49
• 3.6.3 ADI蛋白性质对比结果分析49-51
• 3.7 本章小结51-53
• 4 精氨酸脱亚胺酶PEG修饰研究53-70
• 4.1 前言53
• 4.2 材料53-55
• 4.2.1 主要试剂53-54
• 4.2.2 主要设备和仪器54
• 4.2.3 主要缓冲配制54-55
• 4.3 方法55-60
• 4.3.1 不同比例PEG修饰研究：55
• 4.3.2 修饰产物的的纯化55-56
• 4.3.3 PEG修饰产物的性质研究56-60
• 4.3.3.1 修饰产物的纯度度检测56-57
• 4.3.3.2 修饰产物浓度测定57
• 4.3.3.3 平均修饰度测定及对比分析57-59
• 4.3.3.4 酶活测定59-60
• 4.4 结果与讨论60-69
• 4.4.1 修饰产物的纯化60-61
• 4.4.2 PEG修饰产物的性质研究61-69
• 4.4.2.1 修饰产物的纯度度检测61-64
• 4.4.2.2 平均修饰度测定及对比分析64-67
• 4.4.2.4 酶活测定67-69
• 4.5 本章小结69-70
• 5 结论与展望70-72
• 5.1 结论70
• 5.2 本文的创新性70
• 5.3 展望70-72
• 致谢72-73
• 参考文献73-76
• 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果76

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本文编号：804128