双吲哚马来酰亚胺类化合物BMA-155抗肿瘤活性及其机制的研究

发布时间：2017-09-07 22:40

  本文关键词：双吲哚马来酰亚胺类化合物BMA-155抗肿瘤活性及其机制的研究

  更多相关文章： BMA-155 HepG-2细胞 NF-κB/p65 p53 自噬 凋亡

【摘要】：恶性肿瘤是当今危害人类健康甚至危及生命的主要疾病之一。随着老龄化问题的日益严重,其发病率逐年上升。而且,由于社会发展水平的提高和人们生活质量的提升,患者逐渐趋于年轻化。据报道,估计2020年时的恶性肿瘤的发病率会增加一倍。肝癌是世界上十分常见的恶性肿瘤,因其在中国的发病率极高,还被称作是“中国特色的肿瘤”。癌症具有易突变易转移且易产生耐药性等特点,使得根治癌症非常困难。目前常见的肿瘤治疗方法包括手术、放疗和化疗三种,且临床用药的毒副作用大,容易伤害机体的正常细胞、组织和器官。由此,许多研究学者开始寻找低毒高效的新型化疗药物,这也成为目前肿瘤治疗方面的一个重要的研究方向。中国海洋大学朱伟明课题组在从海洋微生物中发现抗肿瘤活性的新型吲哚咔巴唑生物碱的基础上,开展了对双吲哚马来酰亚胺类生物碱结构修饰和构效关系的研究工作,设计并合成了一系列双吲哚马来酰亚胺类化合物,它们是一类具有烷基和腈基链的取代的结构。我们的前期研究已表明这些化合物能够抑制多株肿瘤细胞的生长。在初步筛选的过程中,我们发现修饰合成的双吲哚马来酰亚胺化合物BMA.155在诱导肿瘤细胞凋亡之外,还会诱导肿瘤细胞自噬。自噬也是细胞程序性死亡的一种方式,区别于凋亡性程序性细胞死亡(Ⅰ型程序性细胞死亡),自噬又称为Ⅱ型程序性细胞死亡。细胞自噬是生物界一种基本的、普遍存在的生命学现象和过程,细胞可以不断摄取和自我消化细胞自身的细胞质成分。细胞自噬是真核生物维持内环境稳态的重要机制,主要是保护真核生物在不同的环境条件下生存下来,包括营养缺乏、生长因子缺乏、毒性蛋白集聚物的产生、细胞器结构与功能出现错误或其他微生物的入侵等。经过初步的镜下观察,我们以人肝癌细胞HepG-2细胞为研究对象,初步探讨了双吲哚马来酰亚胺类化合物BMA-155的诱导肿瘤细胞自噬和凋亡的形态学变化及信号通路的调控。本课题的研究为BMA-155作为临床用药的美好前景提供了一定的理论依据。我们以HepG-2细胞株为研究对象,阐明了BMA-155对人肝癌细胞HepG-2自噬及凋亡的特征及其分子调控机制。我们通过MTT法检测了BMA-155对肝癌细胞HepG-2细胞株生长的抑制作用,实验结果显示出BMA-155对肝癌细胞HepG-2细胞的细胞毒性呈时间和剂量的依赖性。用光学显微镜、电子透射显微镜、流式细胞仪检测发现,化合物BMA-155处理细胞6 h后,细胞出现自噬现象,化合物诱导细胞15 h时的自噬现象最显著。继续延长给药时间至24 h时,细胞出现明显的凋亡特征。我们通过DAPI染色和Annexin V/PI双染等手段检测发现,不同浓度的化合物BMA-155处理细胞后,细胞出现皱缩、染色质聚集、形成凋亡小体等典型的凋亡特点。到这里,我们确定化合物BMA-155能够诱导细胞自噬和凋亡。为了进一步确定自噬和凋亡之间的关系,我们借助了自噬的小分子特异性抑制剂3-MA。MTT细胞毒性检测结果发现,抑制自噬后,BMA-155诱导的细胞凋亡率升高(由IC50=16.6μM降低至IC50=9.5μM),即自噬的发生可以在一定程度上抑制BMA-155诱导德细胞凋亡。我们推测,细胞自噬在BMA-155诱导HepG-2细胞死亡的过程中起着一定的保护作用。另外,我们知道自噬和凋亡都是由一系列的基因调控,通过转录、翻译和翻译后修饰等调控各种生物反应。我们通过RT-PCR技术检测了BMA-155诱导后,细胞内基因NF-κB /p65 mRNA,p53 mRNA和自噬相关基Beclinl mRNA,凋亡相关基因Bax mRNA的水平均有所升高；另外,WesternBlot实验结果显示,BMA-155药物处理细胞后,自噬相关蛋白LC3B和Beclin-1的表达量升高,促凋亡相关蛋白Bax的表达量升高,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量降低。BMA-155也能够促进NF-KB/p65及p53的活化,使得p-p53表达水平上升,IκB的表达量下降。BMA-155对蛋白表达的影响同样呈现时间和剂量的依赖性。此外,我们发现,用NF-κB/p65特异性抑制剂 BAY 11-7082抑制NF-κB/p65的活化可以降低BMA-155诱导的细胞凋亡和自噬相关蛋白的表达。我们知道,由于化合物本身的特性(如水溶性、脂溶性等),许多化合物在体外的实验效果显著,但是再体内的作用效果并不理想。为此,我们建立了裸鼠皮下移植瘤模型,通过裸鼠体重及肿瘤体积的测量、免疫组化、HE(苏木-伊红染色)、WesternBlot等检测方法检测了BMA-155给药18天后的情况。结果表明BMA-155在体内也能够抑制肿瘤生长,且效果良好。综上所述,BMA-155在体内和体外均可以诱导肿瘤细胞自噬和凋亡。在人肝癌细胞HepG-2细胞中,细胞自噬在细胞死亡的过程中发挥了保护性作用,而且BMA-155诱导的细胞自噬和凋亡有NF-κB/p65—p53信号通路的参与。本课题首次对双吲哚马来酰亚胺类的生物碱BMA-155进行抗肝癌活性及其分子调控机制的研究。实验结果显示：BMA-155是一个具有美好前景的抗肿瘤先导化合物。我们的研究也为其今后的进一步研究与临床开发提供了可观的理论依据。
【关键词】：BMA-155 HepG-2细胞 NF-κB/p65 p53 自噬 凋亡
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要10-13
• ABSTRACT13-16
• 缩略语词汇表16-18
• 第一章 绪论18-35
• 1.1 肿瘤及其常规治疗方法18-19
• 1.2 细胞程序性死亡19-26
• 1.2.1 细胞凋亡20-22
• 1.2.2 细胞自噬22-24
• 1.2.3 细胞坏死24-25
• 1.2.4 细胞凋亡与细胞自噬的关系25
• 1.2.5 细胞凋亡与细胞坏死的区别25-26
• 1.3 活性氧(reactive oxygen species,ROS)26-27
• 1.4 自噬的分子调控27-30
• 1.4.1 微管结合蛋白-1轻链-3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)28-29
• 1.4.2 Beclin129-30
• 1.5 凋亡的分子调控30-32
• 1.5.1 Bcl-2与Bax30-31
• 1.5.2 NF-κB与IκB31-32
• 1.6 p53与细胞凋亡32-33
• 1.7 BMA-155(Bisindolylmaleimide alkaloid-155)33-35
• 第二章 BMA-155诱导人肝癌细胞自噬及凋亡的形态学研究35-53
• 2.1 实验材料35-37
• 2.1.1 细胞株35-36
• 2.1.2 化合物36
• 2.1.3 试剂36
• 2.1.4 主要试剂配制36-37
• 2.1.5 仪器37
• 2.2 试验方法37-40
• 2.2.1 细胞复苏及培养37-38
• 2.2.2 MTT法检测BMA-155的细胞毒性38
• 2.2.3 细胞自噬的形态学观察38-39
• 2.2.4 MDC染色39
• 2.2.5 DAPI染色39
• 2.2.6 FITC-Annexin V/PI双染定量检测细胞凋亡39-40
• 2.2.7 DCFH-DA染色检测ROS水平40
• 2.2.8 数据分析40
• 2.3 实验结果40-51
• 2.3.1 MTT检测结果40-43
• 2.3.2 显微镜下观察细胞的形态学变化43-45
• 2.3.3 MDC染色45-47
• 2.3.4 DAPI染色47-48
• 2.3.5 BMA-155诱导细胞凋亡,抑制自噬会增强细胞凋亡48-49
• 2.3.6 BMA-155诱导HepG-2细胞内ROS水平升高49-51
• 2.4 讨论51-53
• 第三章 BMA-155诱导人肝癌细胞HepG-2自噬及凋亡的分子生物学研究53-72
• 3.1 实验材料53-55
• 3.1.1 细胞株53
• 3.1.2 化合物53-54
• 3.1.3 试剂54
• 3.1.4 主要试剂配制54-55
• 3.1.5 仪器55
• 3.2 实验方法55-61
• 3.2.1 细胞复苏及培养55-56
• 3.2.2 免疫荧光染色56
• 3.2.3 RNA提取及实时定量PCR检测56-57
• 3.2.4 Western blot蛋白印迹57-60
• 3.2.5 BMA-155在体内对肝癌细胞的抑制作用60
• 3.2.6 HE染色60
• 3.2.7 免疫组化染色60-61
• 3.2.8 数据分析61
• 3.3 实验结果61-69
• 3.3.1 BMA-155诱导的HepG-2细胞内LC3累积61-62
• 3.3.2 BMA-155在体外促进NF-κB,p53,Beclin-1和Bax等基因的表达62-63
• 3.3.3 BMA-155体外调控自噬及凋亡相关蛋白的表达63-65
• 3.3.4 BMA-155体外增强NF-κB/p65、p53、p-p53等信号蛋白的表达65-66
• 3.3.5 BMA-155在体内的细胞毒作用66-68
• 3.3.6 BMA-155能够引起体内肿瘤组织坏死68
• 3.3.7 BMA-155诱导体内自噬及凋亡相关蛋白的变化68-69
• 3.4 讨论69-72
• 创新与展望72-73
• 附录73-78
• 参考文献78-84
• 致谢84-85
• 攻读学位期间发表的论文85-86
• 学位论文评阅及答辩情况表86

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