谷胱甘肽的合成及其活性的初步评价

发布时间：2017-09-18 08:32

  本文关键词：谷胱甘肽的合成及其活性的初步评价

  更多相关文章： 谷胱甘肽 Fmoc固相合成 切割 分离纯化 氧化 分析鉴定 急性肝损伤 生物活性

【摘要】：谷胱甘肽(Glutathione)是人体内源活性肽之一,广泛存在于动、植物中,在生物体内有着重要的作用。现代药理实验表明,其不仅具有较强的清除自由基作用,还可以用于肝、肾细胞膜的保护、有机物中毒、抑制肺间质纤维化等多种生理功能。现被广泛应用于肝肾保护、解毒、抗癌等医学领域[1]。由于其分子小,容易被肌体吸收,不易被消化酶破坏,可作为食品添加剂,提高营养,加强食品风味及防止变质[2],同时可制成复合制剂和保健药品用于人体保健[3-5],此外将其添加到化妆品中,美白效果明显优于普通化妆品。近年来,国内外对谷胱甘肽的作用机制等已经做了大量的理论和实践研究。目前的研究主要集中在药理作用和新用途开发上,随着其应用范围越来越广,需求量日益增加,而目前的生产工艺方法如发酵法等因胞内产物含量低,细胞密度低、生产周期长等问题,生产规模有限,不能很好的适应工业化生产的需求。还原型谷胱甘肽(GSH)由谷、胱、甘种氨基酸组成,谷氨酸分别以α和γ羧基形成酰胺键,得到α-GSH与γ-GSH。其中α-GSH是非天然产物肽,其保留了活性位点-游离巯基(-SH),本研究中动物实验研究表明,其肝损伤治疗作用显著。目前合成方法以液相合成法为主,但因操作复杂、生产周期长,不易纯化等,应用受到限制。而氧化型谷胱甘肽(GSSG)是γ-GSH很好的协同抗氧化药物,目前合成以双氧水法为主,但其存在成本高、生产周期较长等问题。故探索国产谷胱甘肽的合成新工艺,并对工艺条件进行优化,以降低成本,成为越来重要的课题。本研究先采用Fmoc固相合成法,以2-Cl-CTC树脂为载体,DIC/HOBt为缩合剂,逐步缩合得到肽树脂,经不同的裂解剂裂解得粗肽,经半制备纯化后冻干,得α-GSH、γ-GSH纯品。γ-GSH分别经空气、碘、双氧水氧化后得GSSG。半制备纯化后得纯品,ESI-MS进行结构分析鉴定,并比较三种合成药物(α-GSH、γ-GSH、GSSG),与阳性对照药(γ-GSH,发酵法所得)对四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤的疗效差异,通过肝细胞形态学变化进行疗效确证。为大规模生产实现提供基础和理论支持。第一部分谷胱甘肽的化学合成目的:先采用fmoc固相合成方法合成α-gsh、γ-gsh,再利用不同的氧化方法将γ-gsh氧化为gssg,探索合成、切割、氧化、纯化等条件,并确立所得产物的检测方法,最终得到纯度较高的目标产品。方法:1还原型谷胱甘肽的固相合成(α-gsh、γ-gsh)以fmoc固相合成方法分别合成α-gsh、γ-gsh。选择适合、廉价的树脂为载体,使用高效、副反应少、廉价的缩合体系,探索树脂替代度、投料摩尔比、反应时间、反应温度对合成结果的影响,以尽可能减少接肽过程中的副反应,最终获得较好的纯度和收率;接肽过程中利用kaiser反应以检测氨基酸的连接程度。2肽树脂的切割、纯化根据氨基酸保护基团的不同,选择不同的切割试剂配方,平行试验,以粗肽的纯度和收率为指标,优化切割条件;切割后的多肽经冰乙醚沉淀后得粗肽,真空干燥至恒重;反相半制备型hplc分离纯化,冷冻干燥后获得最终产品。3gssg的制备及纯化以γ-gsh纯品为原料,分别采用空气、双氧水、碘氧化法将其氧化为gssg;hplc监测,以峰面积百分比为指标,优化各种方法的反应条件;在各自的优化条件下,以产物纯度和收率为指标,以获得较优的氧化方法。4三种谷胱甘肽的结构分析鉴定利用标准品hplc,对合成的α-gsh、γ-gsh、gssg进行定位,并进行hplc纯度分析;esi-ms分析确证各自的分子量。结果:1α-gsh、γ-gsh为短肽,没有复杂的空间结构,故选择适合短肽合成且较廉价的2-cl-ctc树脂为载体;缩合体系选择产生高效、副反应少的dic/hobt;反应投料比在1:3时能充分反应;反应时间2.5h即可,但由于cys易消旋,宜缩短反应时间在2h左右;反应温度以室温(25℃~35℃)较好;替代度在0.9~0.95mmol/g时较好,优选0.94mmol/g。2γ-gsh的四种切割试剂脱除保护基的效果相似,但有差异,综合考虑所得粗肽纯度、收率及成本,以切割配方tfa:edt:间甲酚(95:4:1)较优。α-gsh肽树脂的裂解效果与之类似。切割实验时,反应液宜在冰浴之中冷冻0.5h,再逐步升至室温(30℃)继续反映1h得到的产物副反应少,纯度好,产品稳定且收率较高。3通过hplc图谱峰面积百分比比较,获得了各自较优的氧化条件:空气(室温、底物浓度20mg/ml、ph6,反应72h);碘(室温、底物浓度150mg/l、碘与底物摩尔比1:1.5,ph3,反应0.5h);双氧水(室温、底物浓度200mg/ml、30%双氧水用量5%,ph6,反应时间2h);在各自优化条件下,各氧化法所得gssg纯度分别为90%、98%、95%,收率分别为70%、90%、91%。4合成的α-gsh、γ-gsh、gssg经hplc经标准品定位,esi-ms确证分子量,合成正确;所获得的α-gsh、γ-gsh纯品的纯度大于99%,gssg纯度大于98%。结论:本课题先采用fmoc固相合成法合成得到了α-gsh、γ-gsh纯品,并在氧化剂作用下将γ-gsh纯品氧化成gssg;在合成过程中优化了合成、裂解、氧化、纯化等条件;所得产物经hplc定位,esi-ms确证分子量,均与理论值相符。第二部分合成谷胱甘肽对小鼠急性肝损伤疗效初步评价目的:通过动物实验观察三种合成谷胱甘肽(α-gsh、γ-gsh、gssg,实验室合成)与阳性对照药(注射用γ-gsh,市售)对四氯化碳(ccl4)诱导的小鼠急性肝损伤的治疗效果,以初步评价其活性。方法:1采用经典的ccl4诱导昆明系成年雄性小鼠急性肝损伤方法造模;造模成功后,每24h按80mg/kg、40mg/kg、20mg/kg剂量给予小鼠合成药物,并设立对照组,连续腹腔注射给药7d,观察各组小鼠血清中alt、ast活性水平的变化,并对实验结果进行两样本均数的t检验统计学分析。2给药7 d后处死动物,采取各组小鼠新鲜肝脏组织,HE染色后,观察各组细胞形态学差异,以确定合成谷胱甘肽对小鼠急性肝损伤的疗效。结果:1通过各组间两样本t检验知,三种合成化学物高剂量(80 mg/kg)、中剂量(40 mg/kg)可以显著降低小鼠血清中ALT、AST水平(P0.01),且其治疗效果与同等剂量的注射用γ-GSH无显著性差异(P0.05),而低剂量(20 mg/kg)可以一定程度的降低小鼠肝脏ALT、AST水平(P0.05)。2小鼠肝脏组织经HE染色后,显微镜下观察发现,正常对照组,三组高、中剂量给药组小鼠肝细胞排列规则,形态结构较正常,核质分布均匀,中央静脉及汇管区清晰可见,CC14模型组小鼠肝组织损伤严重,肝细胞排列紊乱,多数肝细胞水肿,有明显的坏死现象,坏死区肝细胞发生不同程度的气球样变,肝窦以及肝中央静脉扩张。结论:合成的谷胱甘肽高(80 mg/kg)、中(40 mg/kg)剂量都可显著降低小鼠肝脏ALT、AST水平,且其治疗效果与同等剂量的注射用γ-GSH无显著差异,提示该方法可以考虑作为谷胱甘肽合成新方法。
【关键词】：谷胱甘肽 Fmoc固相合成 切割 分离纯化 氧化 分析鉴定 急性肝损伤 生物活性
【学位授予单位】：承德医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914.5;R96
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 英文缩写15-16
• 引言16-18
• 第一部分 谷胱甘肽的化学合成18-56
• 前言18
• 材料与方法18-30
• 结果30-33
• 附图33-44
• 附表44-50
• 讨论50-53
• 小结53-54
• 参考文献54-56
• 第二部分 合成谷胱甘肽对小鼠急性肝损伤保护作用初步评价56-72
• 前言56-57
• 材料与方法57-60
• 结果60-62
• 附图62-64
• 附表64-68
• 讨论68-69
• 小结69-70
• 参考文献70-72
• 结论72-73
• 综述73-80
• 参考文献78-80
• 致谢80-81
• 个人简历81

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 金春英;崔京兰;崔胜云;;氧化型谷胱甘肽对还原型谷胱甘肽清除自由基的协同作用[J];分析化学;2009年09期

2 李新社;;COPD患者行机械通气治疗时应用还原型谷胱甘肽的临床效果[J];中国医学工程;2012年12期

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本文编号：874477