重组人白细胞介素-29突变体的真核表达及抑制肿瘤细胞增殖分析

发布时间：2017-09-18 13:25

  本文关键词：重组人白细胞介素-29突变体的真核表达及抑制肿瘤细胞增殖分析

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【摘要】：人白细胞介素-29(Interleukin-29,h IL-29),也被称作干扰素λ1,为2003年发现的一种新型细胞因子。hIL-29与其受体复合物(由IFN-λR1及IL-10R2两个亚基组成)结合激活JAK-STAT信号转导通路,因此h IL-29的生物学效应包括抑制肿瘤增殖、抗病毒和免疫调节等。h IL-29的受体表达具有组织特异性,因此h IL-29的毒副作用较小,故有望成为新型基因工程类药物进一步研究开发。用生物信息学软件将hIL-29的三级结构与人白细胞介素-28B(Interleukin-28B,h IL-28B)的晶体结构进行比对发现,h IL-29在A螺旋中有3个氨基酸残基(33Lys、35Arg、43Lys)与hIL-28B中对应氨基酸残基(34Arg、36Lys、44Leu)不同,F螺旋中143Ala与IL-28B中144Pro不同。以h IL-28B的相应氨基酸为参照,对hIL-29中43Lys和143Ala进行定点突变,并研究h IL-29突变体抗肿瘤细胞增殖活性。采用大引物PCR方法对hIL-29基因进行点突变,得到的hIL-29突变体基因经重组后转化毕赤酵母GS115和诱导表达,经纯化获得重组蛋白质hIL-29K43L和hIL-29A143P,高效液相色谱检测纯度达到98.17%和97.83%。经过SDS-PAGE分析显示重组蛋白质的相对分子量约23.0 kDa,Western-Blotting鉴定显示其与羊抗人IL-29多克隆抗体发生特异性结合反应。用CCK-8试剂检测重组蛋白质hIL-29K43L和hIL-29A143P对肿瘤细胞株(人胃癌SGC7901、人结肠癌HCT8、人肝癌BEL7402、人肺腺癌A549和人急性单核白血病THP1)增殖的影响检测,结果显示h IL-29K43L和h IL-29A143P对上述肿瘤细胞株均有抑制作用,而且高剂量组的抗增殖效应高于野生型rhIL-29的,其中hIL-29K43L对上述肿瘤细胞增殖的抑制率为(29.42±1.76)%、(29.42±1.76)%、(29.42±0.74)%、(27.09±3.85)%和(25.09±3.89)%;h IL-29A143P对上述肿瘤细胞增殖的抑制率为(25.20±3.30)%、(23.84±2.93)%、(28.57±0.80)%、(25.96±1.41)%和(27.86±1.63)%。表明对h IL-29的受体结合区域氨基酸进行改造,可以提高其抗肿瘤细胞增殖活性,这为进一步研制开发h IL-29的抗肿瘤药物奠定基础。
【关键词】：人白细胞介素-29 定点突变 重组蛋白质 抗肿瘤细胞增殖活性
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 绪论7-17
• 1.1 干扰素的概述7
• 1.2 h IL-29的结构7-8
• 1.2.1 IL-29的基因结构7-8
• 1.2.2 h IL-29的蛋白质结构8
• 1.3 h IL-29的表达8-9
• 1.4 h IL-29的受体及其信号转导通路9-10
• 1.4.1 h IL-29受体组成9
• 1.4.2 h IL-29受体的表达9
• 1.4.3 h IL-29的信号转导通路9-10
• 1.5 h IL-29的生物学效应10-13
• 1.5.1 h IL-29的抗病毒活性11-12
• 1.5.2 h IL-29的免疫调节活性12
• 1.5.3 IL-29的抗增殖活性12
• 1.5.4 h IL-29的抗肿瘤活性12-13
• 1.6 h IL-29的临床应用及国内研究进展13-14
• 1.6.1 h IL-29的临床应用13
• 1.6.2 h IL-29的国内研究进展13-14
• 1.7 立题意义和主要内容14-17
• 1.7.1 立题意义14-15
• 1.7.2 主要内容15-17
• 第二章 材料与方法17-34
• 2.1 实验材料17-19
• 2.1.1 菌株、质粒和重组蛋白质17
• 2.1.2 实验细胞株17
• 2.1.3 主要试剂及耗材17-18
• 2.1.4 培养基18
• 2.1.5 主要仪器18-19
• 2.1.6 常用试剂的配制19
• 2.2 实验方法19-34
• 2.2.1 h IL-29突变位点的确定19
• 2.2.2 PCR引物设计及合成19-20
• 2.2.3 h IL-29变异体cDNA的克隆20-21
• 2.2.4 重组克隆质粒pUCm-T-hIL-29K43L和pUCm-T-hIL-29A143P的构建21-24
• 2.2.5 重组表达质粒pPIC9KM-hIL-29K43L和pPIC9KM-hIL-29A143P的构建24-26
• 2.2.6 重组表达质粒转化毕赤酵母及高拷贝重组菌株的筛选鉴定26-27
• 2.2.7 重组菌株的诱导表达及高产菌株的筛选27-29
• 2.2.8 重组蛋白质rh IL-29K43L、rhIL-29A143P的分离纯化与鉴定29-31
• 2.2.9 抗肿瘤细胞增殖活性分析31-34
• 第三章 结果与讨论34-48
• 3.1 h IL-29突变位点的确定34
• 3.2 h IL-29变异体cDNA的克隆34-35
• 3.3 重组克隆质粒pUCm-T-hIL-29K43L和pUCm-T-hIL-29A143P的构建及鉴定35-36
• 3.3.1 pUCm-T-hIL-29K43L和pUCm-T-hIL-29A143P的菌液PCR鉴定35-36
• 3.3.2 pUCm-T-hIL-29K43L和pUCm-T-hIL-29A143P的双酶切鉴定36
• 3.4 重组表达质粒pPIC9KM-hIL-29K43L和pPIC9KM-hIL-29A143P的构建及鉴定36-37
• 3.5 重组质粒转化毕赤酵母及高拷贝重组菌株的筛选鉴定37-38
• 3.6 重组菌株的诱导表达及高产菌株的筛选38-39
• 3.6.1 重组菌株的诱导表达38
• 3.6.2 SDS-PAGE鉴定表达产物及高产菌株筛选38-39
• 3.6.3 Western-Blotting鉴定重组蛋白质rhIL-29K43L、rhIL-29A143P39
• 3.7 重组蛋白质rhIL-29K43L、rhIL-29A143P分离纯化与鉴定39-42
• 3.7.1 重组蛋白质rh IL-29K43L、rhIL-29A143P分离纯化39-40
• 3.7.2 SDS-PAGE分析鉴定40-41
• 3.7.3 Western-Blotting分析鉴定41-42
• 3.7.4 高效液相色谱色谱（HPLC）纯度鉴定42
• 3.8 抗肿瘤细胞增殖活性分析42-48
• 3.8.1 抗人胃癌SGC7901细胞的增殖活性分析42-43
• 3.8.2 抗人结肠癌HCT8细胞的增殖活性分析43-44
• 3.8.3 抗人肝癌BEL7402细胞的增殖活性分析44-45
• 3.8.4 抗人肺腺癌A549细胞的增殖活性分析45-46
• 3.8.5 抗人急性单核白血病THP1细胞增殖分活性分析46-48
• 主要结论与展望48-50
• 主要结论48
• 展望48-50
• 致谢50-51
• 参考文献51-56
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文56

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本文编号：875802