金属离子胁迫海洋真菌桔青霉合成多样性次生代谢产物的研究

发布时间：2017-09-24 11:37

  本文关键词：金属离子胁迫海洋真菌桔青霉合成多样性次生代谢产物的研究

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【摘要】：从我国东海海水和海泥中分离到6株霉菌,对获得的菌株进行了抗肿瘤细胞活性的筛选,选择了一株抗肿瘤活性较好的菌株,对其进行金属离子胁迫培养,分析胁迫培养下其代谢产物的多样性,在对胁迫培养条件下新合成的次生代谢产物进行分离纯化,利用核磁共振法对它们的结构进行鉴定,最后对分离得到的单体化合物做抗肿瘤活性评价,得到结果如下:(1)采用稀释平板分离法,从我国东海海域的海水和海泥样品分离到5株菌落形态有明显差别的海洋真菌。利用体外抗肿瘤模型对上述5株霉菌和1株实验前期研究分离的桔青霉(Penicillium citrinum)MNP12010101进行活性筛选,结果表明:桔青霉菌株MNP12010101发酵总浸膏对人肺腺癌细胞(A549)有较好的抑制活性,200μg·mL-1浓度时对A549的抑制率为55.37%,IC50为141.12μg·mL-1,其次是菌株JHBL-1,其发酵浸膏在200μg·mL-1时,对A549的抑制率为33.46%。依据形态学特征和18S rDNA序列分析,确定JHBL-1菌株是一株毛霉(Mucor sp.)。(2)对桔青霉MNP12010101进行金属离子胁迫培养,采用HPLC指纹图谱法分析代谢产物的多样性,结果表明:在人工海水培养基中,添加10 mmoL·L-1的Co2+胁迫培养后,MNP12010101菌株的代谢产物种类与常规培养产物差异较大,有较多的新化合物出现,且活性检测结果显示其总浸膏抗肿瘤活性明显增强,IC50值由胁迫前的141.12μg·mL-1降低至61.23μg·mL-1,说明桔青霉MNP1201010在10 mmol·mL-1Co2+的胁迫培养下,原有的活性代谢产物的浓度提高,或合成了新的活性代谢产物。(3)对桔青霉MNP12010101进行大批量培养,获得80 L培养液,制备得到发酵液和菌体混合总浸膏16 g。通过柱层析方法分离出11个化合物,经过核磁共振分析,确定了其中7个化合物的结构,它们分别为:十八烯酸(1)、cladospolide E(2)、过氧麦角甾醇(3)、环(甘-脯)二肽(4)、环(丙-脯)二肽(5)、环(异亮-脯)二肽(6)和环(丙-缬)二肽(7)。化合物3,4,5,6,7首次从桔青霉中分离得到。抗肿瘤活性研究表明:化合物3具有较好的抗肿瘤活性,其对人前列腺癌(PC-3)细胞的IC50值为33.12μg·mL-1,化合物2和4具有弱的抗肿瘤活性,它们对PC-3肿瘤细胞的IC50值分别为199.34μg·mL-1和146.22μg·mL-1;对A549肿瘤细胞的IC50值分别为256.22μg·mL-1和178.56μg·mL-1。所有化合物均未发现对人结肠癌细胞(HCT116)细胞有抑制作用。除化合物3外,其他化合物对PC-3,A549和HCT116肿瘤细胞的活性的报道也属首次。
【关键词】：海洋真菌 桔青霉(Penicillium citrinum) 金属离子胁迫 次级代谢产物 抗肿瘤活性活性
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R915;R96
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 绪论14-28
• 1.1 海洋微生物研究概述14-16
• 1.2 极端微生物的代谢产物及其生物活性研究概述16-20
• 1.2.1 耐冷菌16-17
• 1.2.2 耐热菌17
• 1.2.3 耐酸菌17-18
• 1.2.4 耐碱菌18
• 1.2.5 耐盐菌18-20
• 1.2.6 耐高压菌20
• 1.3 海洋真菌化学成分及生物活性研究进展20-23
• 1.4 环境胁迫提高次生代谢产物合成多样性的研究进展23-25
• 1.4.1 环境胁迫对植物次生代谢产物积累的影响23
• 1.4.2 环境胁迫对微生物生成次生代谢产物的影响23-25
• 1.5 海洋真菌青霉（Penicillium）的代谢产物及其生物活性研究概述25-26
• 1.6 本课题立项背景、意义和研究内容26-28
• 1.6.1 海洋真菌的分离和抗肿瘤活性筛选26
• 1.6.2 金属离子胁迫海洋真菌合成代谢产物多样性分析26-27
• 1.6.3 金属离子胁迫海洋真菌次生代谢产物的分离纯化、结构鉴定和活性研究27-28
• 第二章 海洋真菌活性菌株的筛选28-38
• 2.1 引言28
• 2.2 材料和方法28-32
• 2.2.1 实验材料28-31
• 2.2.1.1 微生物分离的样品来源28
• 2.2.1.2 实验细胞28
• 2.2.1.3 实验试剂28-29
• 2.2.1.4 实验仪器29-30
• 2.2.1.5 主要实验试剂的配制30
• 2.2.1.6 培养基的配制30-31
• 2.2.2 实验方法31-32
• 2.2.2.1 海洋真菌分离31
• 2.2.2.2 海洋真菌的培养及浸膏的制备31
• 2.2.2.3 体外抗肿瘤活性模型研究31-32
• 2.2.2.4 海洋真菌的菌种鉴定32
• 2.3 结果与分析32-37
• 2.3.1 海洋真菌初步筛选结果32-33
• 2.3.2 抗肿瘤筛选结果33-35
• 2.3.3 海洋真菌JHBL-1 的鉴定结果35-37
• 2.4 本章小结37-38
• 第三章 金属离子胁迫培养桔青霉MNP12010101合成代谢产物多样性分析38-53
• 3.1 引言38
• 3.2 材料和方法38-41
• 3.2.1 实验材料38-40
• 3.2.1.1 实验菌株38
• 3.2.1.2 主要实验试剂和仪器38-40
• 3.2.2 实验方法40-41
• 3.2.2.1 金属离子胁迫培养方法40
• 3.2.2.2 代谢产物分析方法40
• 3.2.2.3 胁迫产物抗肿瘤活性分析40-41
• 3.3 结果与分析41-52
• 3.3.1 Mg~(2+)胁迫培养结果41-42
• 3.3.2 Mn~(2+)胁迫培养42-43
• 3.3.3 Fe~(3+)胁迫培养结果43-44
• 3.3.4 Na~+胁迫培养培养结果44-45
• 3.3.5 K~+胁迫培养培养结果45-46
• 3.3.6 Ba~(2+)胁迫培养结果46-47
• 3.3.7 Cu~(2+)胁迫培养结果47-48
• 3.3.8 Al~(3+)胁迫培养结果48-49
• 3.3.9 Co~(2+)胁迫培养结果49-52
• 3.4 本章小结52-53
• 第四章 桔青霉MNP12010101胁迫培养下次生代谢产物的分离纯化、结构鉴定及抗肿瘤活性测定53-67
• 4.1 引言53
• 4.2 材料和方法53-56
• 4.2.1 实验材料53-55
• 4.2.1.1 海洋真菌来源53
• 4.2.1.2 主要实验试剂和仪器53-54
• 4.2.1.3 实验仪器54
• 4.2.1.4 培养基的配制54
• 4.2.1.5 主要试剂的配制54-55
• 4.2.2 实验方法55-56
• 4.2.2.1 海洋真菌MNP12010101的批量发酵培养55
• 4.2.2.2 桔青霉MNP12010101发酵总浸膏的制备55
• 4.2.2.3 桔青霉MNP12010101次生代谢产物成分初步分析55
• 4.2.2.4 单体化合物分离55
• 4.2.2.5 单体化合物的结构鉴定55
• 4.2.2.6 抗肿瘤细胞活性的测定55-56
• 4.3 结果与讨论56-65
• 4.3.1 桔青霉MNP12010101总浸膏的制备56-57
• 4.3.2 对海洋真菌MNP12010101代谢产物的初步分析57-58
• 4.3.3 单体化合物分离结果及对应HPLC图谱位点58-59
• 4.3.4 单体化合物的结构鉴定59-64
• 4.3.4.1 化合物1的结构推断59-60
• 4.3.4.2 化合物2的结构推断60
• 4.3.4.3 化合物3的结构推断60-61
• 4.3.4.4 化合物4的结构推断61-62
• 4.3.4.5 化合物5的结构推断62-63
• 4.3.4.6 化合物6的结构推断63
• 4.3.4.7 化合物7的结构推断63-64
• 4.3.4.8 化合物8和 9 的结构推断64
• 4.3.5 单体化合物抗肿瘤活性测定64-65
• 4.4 本章小结65-67
• 第五章 结论与展望67-70
• 5.1 结论67-68
• 5.2 创新点68
• 5.3 展望68-70
• 参考文献70-75
• 附录75-85
• 攻读硕士学位期间发表的论文和专利85-86
• 致谢86

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张玲;李冬利;陈玉婵;陶美华;章卫民;;南海海洋真菌Penicillium sp. FS60的次级代谢产物研究[J];中药材;2012年07期

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本文编号：911197