Stathmin1基因表达对微管药物抑制细胞增殖作用的影响

发布时间：2017-09-29 03:28

  本文关键词：Stathmin1基因表达对微管药物抑制细胞增殖作用的影响

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【摘要】：Stathminl (STMN1)是一种在脊椎动物细胞中普遍存在的胞质可溶性磷蛋白,含有149个氨基酸,分子量为19KD。在细胞有丝分裂的不同阶段,Stathminl蛋白通过其磷酸化和去磷酸化状态的转变调节活性,能够直接与微管结合,加速微管解聚和重组装的过程,或与游离微管蛋白结合来阻止微管的聚合过程,从而对细胞微管动态系统的调节发挥重要的作用,继而能够高效的调节细胞的增殖和分化。继阿霉素和顺铂后,紫杉醇是最炙手可热的抗癌药物,目前研究发现,紫杉醇在多种肿瘤治疗中起作用,如卵巢癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等。紫杉醇药物作用的靶位点是细胞骨架的微管系统,可以结合在p-微管蛋白N-端第31位氨基酸及217至231位氨基酸上,结合后可促进微管蛋白聚合并稳定微管结构,抑制其解聚,进而影响微管聚合与解聚的动态平衡,导致有丝分裂纺锤体形成受阻,从而使微管排列异常而形成稳定的非功能性微管束,将细胞周期阻断于G2/M期,最终促使细胞生长抑制和凋亡。除紫杉醇外,一种新型的抗癌药物去氧鬼臼毒素(DPPT)最近几年也引起了研究者的关注。去氧鬼臼毒素能够结合微管蛋白上的秋水仙素位点,抑制微管的聚合,从而使细胞周期阻滞在G2/M期,起到抗肿瘤的效果。本实验以正常小鼠的成肌细胞C2C12为实验材料,用两种抗肿瘤药物紫杉醇和DPPT分别处理C2C12细胞48h后,对其进行形态观察,并通过MTT方法检测存活率,分别提取相应总蛋白和总RNA,进一步对其在给药后Stathminl基因以及蛋白表达水平进行检测,初步探讨了两种抗肿瘤药物对正常细胞增殖的影响。结果显示,随着药物浓度的升高,细胞的存活率大致呈马鞍形,即低浓度0.1州和高浓度100州的DPPT药物处理后细胞存活率较高,分别为70.6%和97.9%；低浓度0.1州和高浓度100μM的紫杉醇药物处理后细胞存活率分别为53.7%和98.7%。只有在一定浓度范围内时,随着药物浓度的增加,细胞的存活率降低。不同点在于,DPPT药物在浓度为1州时,细胞存活率达到最低值为55.8%；而紫杉醇在药物浓度为0.51μM时,细胞存活率达到最低值为39.1%。在药效方面,总的来说,DPPT与紫杉醇相比,DPPT处理细胞时,细胞的死亡率小于紫杉醇处理细胞的死亡率；不同浓度的DPPT和紫杉醇分别处理C2C1248h后,通过Western Blot检测细胞STMN1的表达水平,在药物浓度为0.5μM时,Stathminl蛋白表达水平相对于对照组来说分别降低70.6%和77.9%。随着药物浓度增加,Stathminl蛋白表达水平反而有所增加。细胞STMN1的mRNA相对表达水平经逆转录PCR检测后显示,在药物DPPT浓度为0.1μM时,nRNA相对表达水平降低了60.6%,在药物紫杉醇浓度为0.51μM时,mRNA相对表达水平降低了79.9%,之后随着药物浓度的增加,STMN1的mRNA相对表达水平出现一定上升趋势。综上所述,紫杉醇和DPPT的抗癌作用与细胞STMN1表达水平有着密切的联系。本实验以人肺腺癌细胞A549为实验材料,利用RNA干扰技术,成功地构建了人Stathmin1 shRNA干扰表达载体,重组干扰质粒分别命名为STMN1/hshRNA1、STMN1/hshRNA2和STMN1/hshRNA3,采用脂质体转染人肺腺癌细胞A549,通过检测人Stathmin1 shRNA干扰质粒对细胞中Stathmin1表达水平的下调作用来计算出干扰效率,通过转染干扰质粒后的人肺腺癌细胞A549细胞的迁移水平的变化来探讨人Stathmin1基因表达水平与细胞迁移的相关性。Western Blot检测结果显示,STMN1/hshRNA1和STMN1/hshRNA3干扰质粒使A549细胞中Stathmin1蛋白表达水平分别降低了82.2%和78.4%,RT-PCR检测结果显示,STMN1 mRNA的表达水平分别降低了59.1%和54.7%。由此可知,STMN1/hshRNA1和STMN1/hshRNA3干扰质粒的构建,能有效干扰Stathmin1的表达。细胞迁移实验结果显示,相比于转染阴性对照质粒的A549细胞的迁移率,转染干扰质粒STMN1/hshRNA1的细胞迁移率在8h和16h时分别显著降低了63.2%和55.8%,转染干扰质粒STMN1/hshRNA3分别显著降低了72.2%和62.4%。由此说明,STMN1的表达水平的降低,可以明显降低人肺腺癌细胞A549的迁移率。本实验还进一步探讨了Stathmin1干扰和药物联合作用对人肺腺癌细胞A549细胞存活率的影响。结果数据表示,0.5μM紫杉醇和去氧鬼臼毒素作用A549细胞时细胞存活率分别为28.5%和45.8%,然而STMN1/hshRNA1干扰与0.5μM紫杉醇、DPPT联合作用A549细胞时,细胞存活率降低至21.2%和32.4%；STMN1/hshRNA3干扰与0.5μM紫杉醇、DPPT联合作用A549细胞时,细胞存活率降低至27.2%和31.7%,因此,联合作用可以降低肿瘤药物的用量。
【关键词】：Stathmin1 紫杉醇 去氧鬼臼毒素 RNA干扰
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 综述11-19
• 第一节 紫杉醇和DPPT(去氧鬼臼毒素)两种药物与微管的关系11-14
• 1.1 紫杉醇与微管组装的关系11-12
• 1.2 DPPT(去氧鬼臼毒素)与微管组装的关系12-14
• 第二节 Stathmin1基因及其功能14-17
• 2.1 Stathmin1基因14
• 2.2 Stathmin1蛋白14
• 2.3 Stathmin1蛋白与细胞周期14-15
• 2.4 Stathmin1蛋白与肿瘤15
• 2.5 Stathmin1蛋白与肿瘤生物治疗15-16
• 2.6 Stathmin1蛋白在肿瘤生物治疗中的研究现状16-17
• 第三节 RNA干扰技术的研究进展17-18
• 第四节 Stathmin1 shRNA干扰和药物联合处理效果的研究18-19
• 第二章 DPPT(去氧鬼臼毒素)药物对C2C12细胞Stathmin1表达水平的影响19-38
• 2.1 前言19
• 2.2 实验材料19-21
• 2.2.1 主要仪器19-20
• 2.2.2 主要试剂和耗材20
• 2.2.3 主要溶剂配制20-21
• 2.3 实验方法21-26
• 2.3.1 两种药物处理正常小鼠成肌细胞C2C12后观察细胞形态的变化21-22
• 2.3.2 两种药物处理正常小鼠成肌细胞C2C12后测定细胞存活率22
• 2.3.3 两种药物处理正常小鼠成肌细胞C2C12后总蛋白提取22-23
• 2.3.4 两种药物处理正常小鼠成肌细胞C2C12后总RNA提取23-24
• 2.3.5 蛋白质免疫印迹(Western Blot)24-25
• 2.3.6 逆转录PCR(RT-PCR)25-26
• 2.3.7 数据处理与统计26
• 2.4 实验结果26-35
• 2.4.1 DPPT药物处理对正常小鼠成肌细胞C2C12形态的影响26-27
• 2.4.2 紫杉醇药物处理对正常小鼠成肌细胞C2C12形态的影响27-28
• 2.4.3 两种药物处理对正常小鼠成肌细胞C2C12存活率的影响28-29
• 2.4.4 两种药物处理对正常小鼠成肌细胞C2C12 Stathminl的表达水平影响29-31
• 2.4.5 低浓度紫杉醇(0.1×)诱导小鼠成肌细胞系C2C12分化31-33
• 2.4.6 Stathmin1 shRNA干扰质粒通过转染小鼠成肌细胞系C2C12检测干扰效率33-35
• 2.5 讨论35-38
• 第三章 人Stathmin1基因干扰对人肺腺癌细胞A549迁移的影响38-56
• 3.1 前言38
• 3.2 实验材料38-40
• 3.2.1 主要仪器38-39
• 3.2.2 实验菌株、质粒和细胞39
• 3.2.3 主要耗材和试剂39
• 3.2.4 主要溶液配制39-40
• 3.3 实验方法40-45
• 3.3.1 人Stathmin1 shRNA载体的构建40-43
• 3.3.2 人Stathmin1 shRNA干扰效率的鉴定43-44
• 3.3.3 划痕实验检测人Stathmin1 shRNA对人肺腺癌细胞A549迁移的影响44
• 3.3.4 数据处理与统计44-45
• 3.4 实验结果45-53
• 3.4.1 选取合适的RNA干扰片段并且设计shRNA的引物序列45
• 3.4.2 人Stathmin1 shRNA载体的构建及建立45-47
• 3.4.3 人Stathmin1 shRNA干扰质粒转染A549检测干扰效率47-49
• 3.4.4 人Stathmin1 shRNA对人肺腺癌细胞A549迁移的影响49-51
• 3.4.5 人Stathmin1 shRNA干扰质粒通过转染SGC7901检测干扰效率51-53
• 3.5 讨论53-56
• 第四章 Stathmin1基因干扰与药物联合作用对人肺腺癌细胞A549的影响56-61
• 4.1 前言56
• 4.2 实验材料56-57
• 4.2.1 主要仪器56
• 4.2.2 主要试剂和耗材56-57
• 4.2.3 主要溶液配制57
• 4.3 实验方法57-58
• 4.3.1 人肺腺癌细胞A549的培养和转染57
• 4.3.2 MTT法检测细胞的存活率57-58
• 4.3.3 数据处理与统计58
• 4.4 实验结果58-60
• 4.4.1 Stathmin1干扰与药物联合作用对A549及SGC7901细胞存活率影响58-60
• 4.5 讨论60-61
• 全文总结61-62
• 本研究主要结论61
• 存在问题与后续研究打算61-62
• 参考文献62-67
• 在读期间发表的学术论文67-68
• 致谢68

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本文编号：939751