海绵来源Stellettin B的抗肿瘤作用及机理研究

发布时间：2017-09-29 15:04

  本文关键词：海绵来源Stellettin B的抗肿瘤作用及机理研究

  更多相关文章： Stel B A549 SF295 周期阻滞 凋亡 自噬 PI3K/Akt 通路

【摘要】：目的:本文旨在探讨海绵来源化合物Stellettin B(Stel B)对人非小细胞肺癌A549细胞的抗肿瘤作用及分子机理,并在前期工作的基础上研究了对神经胶质瘤SF295细胞自噬的影响,为该类化合物开发成抗肿瘤药物提供初步的理论依据和实验基础。方法:1.利用WST-8实验研究Stel B对A549细胞和SF295细胞的增殖抑制活性。2.利用流式细胞仪检测Stel B对A549细胞周期的影响;利用Western blot方法研究Stel B对细胞周期相关蛋白cyclin D1、Rb和p27的表达或磷酸化水平的影响。3.利用流式细胞术及DAPI染色法评价Stel B是否具有诱导A549细胞凋亡的作用;利用Western blot方法研究Stel B对A549细胞中PARP剪切片段表达水平的影响。利用流式细胞仪检测Stel B对A549细胞内活性氧(ROS)的影响。4.利用多种实验技术包括MDC染色、透射电子显微镜、Western blot以及m RFP-GFP-LC3质粒转染评价Stel B是否具有诱导细胞发生自噬的作用。5.利用Western blot方法研究Stel B对A549和SF295细胞中PI3K/Akt信号通路中相关分子表达或磷酸化的影响。6.利用WST-8法检测应用自噬抑制剂氯喹抑制自噬作用后Stel B抗肿瘤活性的变化。结果:1.Stel B可显著抑制A549细胞的生长增殖,且抑制作用呈现剂量依赖性,IC50值为0.022μM。2.Stel B处理后A549细胞周期停滞在G1期,细胞周期相关蛋白cyclin D1表达下降,p27表达升高,Rb的磷酸化水平降低。3.Stel B处理后荧光倒置显微镜检测可观察到A549细胞内核染色质固缩,出现核碎片及凋亡小体,并且凋亡程度呈剂量依赖性;Stel B可使A549细胞中细胞凋亡相关蛋白PARP的裂解片段增加;ROS水平增加。4.MDC染色显示,Stel B作用后A549细胞核附近亮绿色点状荧光数量增加,荧光强度增强;自噬标志性蛋白LC3Ⅱ的表达量增加;通过透射电镜观察到A549细胞中出现双层膜结构的自噬体;激光共聚焦显微镜观察结果显示细胞从自噬体形成到溶酶体降解的过程顺畅。以上研究结果说明Stel B具有诱导A549细胞发生自噬的作用。5.Stel B可显著抑制SF295细胞的生长增殖,且抑制作用呈现剂量依赖性,IC50值为0.026μM。MDC染色、Western blot分析自噬标记物以及激光共聚焦显微镜检测共同验证了Stel B同样具有诱导SF295细胞发生自噬的能力(我们关于Stel B对SF295细胞周期和凋亡的作用研究已有论文发表)。6.Stel B可明显降低A549细胞中PI3K-p110的表达及PI3K下游Akt、m TOR和p70S6K等蛋白的磷酸化水平;Stel B对SF295细胞中PI3K-p110的蛋白表达及Akt的磷酸化水平也有抑制作用。7.利用自噬抑制剂氯喹阻断自噬后,Stel B对A549和SF295细胞的抑制作用增强。结论:1.Stel B在较低浓度下能够显著抑制A549和SF295细胞的生长增殖,显示出较强的体外抗肿瘤活性。2.Stel B具有同时诱导A549细胞G1期阻滞、凋亡以及自噬的多方面活性。细胞周期停滞可归因于Stel B对Rb磷酸化水平和cyclin D1表达水平的下调,以及p27表达水平的上调。Stel B的诱导凋亡作用可能与增加A549细胞内活性氧水平以及PARP的裂解有关。机制研究表明Stel B通过阻断PI3K/Akt通路使A549细胞发生周期阻滞和诱导细胞凋亡,从而抑制其生长增殖。3.Stel B可诱导SF295细胞发生自噬,但SF295细胞发生自噬的程度低于A549细胞。利用自噬抑制剂氯喹联合干预后两种细胞存活率降低,提示自噬可能对A549和SF295细胞起保护作用。4.Stel B诱导的自噬作用由PI3K/Akt信号通路所介导,其引起周期停滞、凋亡和自噬的关系有待进一步研究。
【关键词】：Stel B A549 SF295 周期阻滞 凋亡 自噬 PI3K/Akt 通路
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语11-13
• 前言13-16
• 研究现状、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、Stel B对非小细胞肺癌A549细胞的抑制作用及机理研究16-42
• 1.1 对象和方法16-29
• 1.1.1 细胞系16
• 1.1.2 主要试剂和药品16-17
• 1.1.3 主要仪器设备17
• 1.1.4 实验方法17-29
• 1.2 结果29-39
• 1.2.1 Stel B对A549细胞的增殖抑制作用29-30
• 1.2.2 Stel B对A549细胞周期的调控作用30-32
• 1.2.3 Stel B对A549细胞凋亡的调控作用32-34
• 1.2.4 Stel B对A549细胞自噬的诱导作用34-37
• 1.2.5 Stel B与CQ共同干预对A549细胞增殖的影响37-38
• 1.2.6 Stel B对A549细胞中PI3K/Akt通路及下游信号分子的影响38-39
• 1.3 讨论39-41
• 1.4 小结41-42
• 二、Stel B诱导神经胶质瘤SF295细胞自噬的作用及机理研究42-50
• 2.1 对象和方法42-44
• 2.1.1 细胞系42
• 2.1.2 主要试剂和药品42-43
• 2.1.3 主要设备仪器43
• 2.1.4 实验方法43-44
• 2.2 结果44-48
• 2.2.1 Stel B对SF295细胞的增殖抑制作用44-45
• 2.2.2 Stel B诱导SF295细胞产生自噬泡45
• 2.2.3 Stel B对SF295细胞自噬过程的影响45-46
• 2.2.4 Stel B对SF295细胞自噬相关蛋白表达水平的影响46-47
• 2.2.5 Stel B与CQ共同干预对SF295细胞增殖的影响47-48
• 2.2.6 Stel B对SF295细胞PI3K/AKT通路的影响48
• 2.3 讨论48-49
• 2.4 小结49-50
• 结论50-52
• 参考文献52-55
• 发表论文和参加科研情况说明55-56
• 综述 海洋抗肿瘤药物的研究进展56-67
• 综述参考文献63-67
• 致谢67-68
• 个人简历68

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本文编号：942656