苯胺洛芬滴眼液新西兰兔单次、多次滴眼给药药动学的定量分析
【摘要】 研究目的为了给苯胺洛芬滴眼液的进一步研究开发以及临床推广提供相应的科学依据，本研究以新西兰兔为实验对象，利用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术，对苯胺洛芬滴眼液新西兰兔单次、多次滴眼给药药物代谢动力学进行研究。建立新西兰兔眼部样品（角膜、结膜、泪液、房水）中联苯乙酸定量分析的LC-MS/MS方法；并准确测定新西兰兔单次、多次滴眼给药苯胺洛芬滴眼液后眼部样品中联苯乙酸的浓度；最后根据测定的联苯乙酸数据结果计算其相应的药物代谢动力学参数，并对药物代谢动力学参数进行相关分析，以此对苯胺洛芬滴眼液新西兰兔单次、多次滴眼给药后，苯胺洛芬在新西兰兔眼内的药物代谢动力学过程进行科学评价。研究方案建立新西兰兔眼部样品（角膜、结膜、泪液、房水）中联苯乙酸定量分析的LC-MS/MS方法。质谱方法：电喷雾离子源，负离子扫描模式，多重反应监测，相应定量离子对分别为联苯乙酸m/z211.1m/z166.9、丙磺舒m/z283.9m/z239.9。液相方法：Venusil MP C18色谱柱（100mm×4.6mm I.D.,5um粒径），乙腈-5mM乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）（70:30，v/v）作为流动相，40°C的柱温箱温度，30uL的进样量，每个样品检测分析时间仅为2.5min，内标为丙磺舒。样品前处理方法：角膜、结膜组织样品制备成匀浆液后进行提取，滤纸片上的泪液样品制备成萃取液后进行提取，房水直接进行提取。提取方法为液液萃取，提取试剂为乙醚：二氯甲烷（3:2，v/v）。本方法按照国家食品药品监督管理局（ChinaFood and Drug Administration，CFDA）指导原则要求，分别从线性范围、最低定量下限、专属性、精密度、准确度、提取回收率、基质效应和样品稳定性等方面进行完全方法确证。利用所建立的LC-MS/MS定量分析方法分别测定了新西兰兔单次、多次滴眼给药苯胺洛芬滴眼液后眼部样品（角膜、结膜、泪液、房水）中联苯乙酸的浓度，并且绘制了药物浓度-时间曲线。根据药物浓度-时间数据求出相关药物代谢动力学参数（达峰浓度、达峰时间、消除半衰期、药-时曲线下面积），并对上述药物代谢动力学参数进行相关分析，考察苯胺洛芬滴眼液新西兰兔单次、多次滴眼给药后，苯胺洛芬在新西兰兔眼内的药物代谢动力学特征。研究结果本研究建立了测定新西兰兔眼部样品（角膜、结膜、泪液、房水）中联苯乙酸浓度的LC-MS/MS定量分析方法，该方法具有简便、快速、灵敏、专属性强、样品用量少（100uL）等优点。该方法在1-300ng/mL的范围内线性良好，最低定量下限可达到1ng/mL；待测物联苯乙酸和内标丙磺舒的检测不受内源性物质的干扰；方法的准确度和精密度均满足相关要求；样品提取回收率高并且稳定；待测物联苯乙酸和内标丙磺舒的检测不受基质效应的影响；样品稳定性试验结果表明：样品经反复冻融三次、-80°С放置3个月、处理前室温放置4h、处理后室温放置4h后均稳定。本方法符合国家相关规范要求，能够满足临床前药物代谢动力学研究的要求，可用于苯胺洛芬滴眼液新西兰兔单次、多次滴眼给药后药物代谢动力学的相关研究。苯胺洛芬滴眼液新西兰兔单次滴眼给药后，角膜、结膜、泪液和房水中待测物联苯乙酸的各药代参数如下：Cmax分别为4059.86±1128.98ng/g、725.13±196.49ng/g、54909.02±9014.14ng/g和272.39±51.62ng/mL；Tmax分别为0.08±0.00h、0.08±0.00h、0.08±0.00h和0.55±0.28h；t1/2分别为2.20±1.53h、2.25±1.67h、1.97±1.06h和3.43±0.32h；AUC0-t分别为8214.22±1375.48h·ng/g、3152.61±1117.28h·ng/g、43597.73±14526.74h·ng/g和667.95±37.28h·ng/g；AUC0-∞分别为8222.48±1991.46h·ng/g、3157.20±1147.21h·ng/g、43698.42±11348.42h·ng/g和668.59±40.58h·ng/g。苯胺洛芬滴眼液新西兰兔多次滴眼给药后，角膜、结膜、泪液和房水中待测物联苯乙酸的各药代参数如下：Cmax分别为5133.24±1556.24ng/g、1434.13±884.93ng/g、21828.41±8102.18ng/g和336.67±136.96ng/mL；Tmax分别为0.08±0.00h、0.08±0.00h、0.08±0.00h和0.46±0.10h；t1/2分别为2.25±1.55h、2.32±1.42h、2.07±1.20h和3.49±0.20h；AUC0-t分别为11659.91±3582.47h·ng/g、4081.22±1659.62h·ng/g、37547.48±1029.03h·ng/g和700.02±93.55h·ng/g；AUC0-∞分别为11660.38±3901.95h·ng/g、4088.62±1724.84h·ng/g、37581.26±1923.01h·ng/g和700.98±93.54h·ng/g。比较上述各药代参数可知：苯胺洛芬滴眼液新西兰兔多次滴眼给药后，在角膜、结膜中可能有轻度蓄积倾向，临床用药应多关注其药物浓度和不良反应；在房水中无蓄积倾向；多次滴眼给药可能会刺激泪液分泌增多，使得泪液对药物浓度起到了稀释的作用。综上所述，本研究为苯胺洛芬滴眼液的进一步研究开发以及临床推广提供了相应的科学依据。
第1章 前言
1.1 变态反应性结膜炎
1.1.1 概述
变态反应性结膜炎（allergic conjunctivitis，AC），又叫过敏性结膜炎，是一种影响眼表面的疾病[1]，其主要是眼结膜接触外界变应原引发的一种超敏反应，通常与 I 型超敏反应有关[2]。
超敏反应（hypersensitivity）又称变态反应（allergy）。其实质主要是一种病理性免疫应答，故也具有特异性和记忆性，其与正常免疫应答的区别在于机体在识别和排除抗原的同时，还造成机体的功能紊乱和/或组织损伤[3]。
Gell 和 Coombs 根据超敏反应的发生机制和临床特点，将其分为 4 型：I 型为速发型，又叫过敏反应（anaphylaxis），主要由 IgE 抗体介导肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放生物活性介质作用于效应器官而发病；II 型又称细胞毒型或细胞溶解型；III 型又称免疫复合物型或血管炎型；IV 型亦称迟发型[4]。I、II和 III 型超敏反应均由抗体介导，发生比较快，可经血清被动转移；IV 型超敏反应与 I、II 和 III 型超敏反应不同，其主要是经由 T 细胞介导的，转移途径主要是经淋巴细胞被动转移，发生速度相对比较慢[5]。
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1.2 苯胺洛芬滴眼液概况
1.2.1 苯胺洛芬的理化性质
苯胺洛芬是（1, 1’-二苯基）-4-乙酸（联苯乙酸）与氨基丁三醇所成的盐（C14H12O2 C4H11O3N，分子量为 333.37），为白色结晶粉末，易溶于甲醇，其中联苯乙酸是本品的活性成分。鉴于苯胺洛芬可迅速解离为联苯乙酸来发挥药效，故本试验检测的对象为苯胺洛芬的游离酸—联苯乙酸，苯胺洛芬结构式如图 1 所示：
1.2.2 苯胺洛芬的药理作用
解热镇痛抗炎药（antipyretic-analgesic and anti-inflammatory drugs）是一类具有解热、镇痛，而且大多数还有抗炎、抗风湿作用的药物。鉴于其抗炎作用与糖皮质激素不同且母体结构中不含甾体结构，故将这类药又称为非甾体类抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）[23]。NSAIDs 主要的共同作用机制是抑制体内环氧化酶活性来减少局部组织前列腺素（prostaglandin，PG）及血栓素的生物合成，从而产生解热、镇痛、抗炎及抗血小板聚集作
【学位级别】：硕士
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第2章 实验部分
2.1 实验设计
2.1.1 药品、试剂与仪器
药品 纯度>99.0%的联苯乙酸尺度品，由广州医药产业研究院药物非临床评价研究中央提供；纯度>99.0%的丙磺舒尺度品，由中国食品药品检定研究院（National Instisutes for Food and Drug Control）提供；受试制剂苯胺洛芬滴眼液（Binaprofen eye Drops），由某公司提供，批号：20120503，规格：5 mL-5 mg。
试剂 购自 SIGMA 中国有限公司的色谱纯乙腈；分别购自天津天泰精细化学品有限公司、北京化工厂的分析纯乙醚、二氯甲烷。超纯水由本实验室 Milli-Q纯水系统制得。
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2.2 分析方法确证
质谱分析 使用甲醇-水(甲醇与水等比例混合)将待测物联苯乙酸及内标丙磺舒充分溶解，然后按照“质谱条件”项所示，设置质谱各参数并进行相应质谱分析，图 2 即为获得的相应二级碎片扫描质谱图。
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第3章 数据结果分析.......................... 57-65
3.1 单次给药.................. 57-61
3.2 多次给药 ......................61-65
第4章 讨论
4.1 LC-MS/MS 定量方法建立
4.1.1 LC-MS/MS 条件优化
质谱条件优化
质谱条件优化是为了最大限度的提高检测灵敏度，以满足微量药物准确检测的要求。本实验采用的扫描方式为多重反应监测（MRM），MRM 是 LC-MS/MS定量分析的标准方法。在摸索 MRM 方法时，采用蠕动泵进样方式，流速20 uL/min。首先进行母离子扫描，同时优化解簇电压（DP），从而获得响应高且稳定的母离子；其次进行子离子扫描，同时优化碰撞能量（CE），从而获得响应高且稳定的子离子；最后在 MRM 模式下优化质谱各参数。待测物联苯乙酸和内标丙磺舒都是酸性物质，在负离子扫描模式下离子化效率更高，获得的信号响应更高；在方法摸索中的确发现[M-H]-的信号响应比[M+H]+高很多，所以选择负离子扫描模式。最终获得的定量离子对分别为：联苯乙酸 m/z 211.1 m/z 166.9、丙磺舒 m/z 283.9 m/z 239.9。其它质谱参数见“质谱条件”项。
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结论
本研究建立了测定新西兰兔眼部样品（角膜、结膜、泪液、房水）中联苯乙酸浓度的 LC-MS/MS 定量分析方法。本方法线性范围较宽（1-300 ng/mL）；每个样品分析测试时间短（仅为 2.5 min）；灵敏度高（LLOQ 为 1 ng/mL）；样品采用液液萃取的提取方法，操作简便快捷，大大节省了试验时间及成本；样品用量少（仅为 100 uL），克服了房水取样量少的难题；综上所述，本方法具有分析时间短、专属性强、准确度高、灵敏度高的特点，完全符合国家相关规定，可用于苯胺洛芬滴眼液新西兰兔单次、多次滴眼给药药物代谢动力学研究。
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参考文献:
- [1] 刘喜东. 药物代谢酶的生物质谱绝对定量方法发展及其应用研究[D]. 吉林大学 2014
- [2] 赵森. 盐酸安舒法辛临床前吸收药物代谢动力学及脑内分布研究[D]. 吉林大学 2014
- [3] 马鸿伟. 盐酸阿那格雷胶囊人体药代动力学研究[D]. 吉林大学 2014
- [4] 国微. 伊潘立酮及其两种主要代谢产物人体内定量分析方法及药代动力学研究[D]. 吉林大学 2014
- [5] 马文晓. 紫杉醇细胞内药代动力学及紫杉醇类药物质谱裂解规律研究[D]. 吉林大学 2013
- [6] 林长庆. 头孢卡品人体内定量分析方法及药代动力学研究[D]. 吉林大学 2013
- [7] 汪静. 卡泊三醇软膏皮肤渗透性研究[D]. 吉林大学 2013
- [8] 张学举. 不稳定药物的稳定型降解产物及其用于评价药物制剂的溶出/释放动力学[D]. 吉林大学 2013
- [9] 杨正慧. 气相色谱—质谱法检测β-受体激动剂残留量的方法研究[D]. 吉林大学 2012
- [10] 李晓娇. 依替巴肽人体内定量分析方法及药代动力学研究[D]. 吉林大学 2012
本文编号：9648
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