新型-N型钙离子通道抑制剂的发现、优化及作用机制研究

发布时间：2017-10-08 10:04

  本文关键词：新型-N型钙离子通道抑制剂的发现、优化及作用机制研究

  更多相关文章： α-芋螺多肽 N-型电压门控钙离子通道 抑制剂 结构活性关系 嵌合肽

【摘要】：芋螺属软体动物(芋螺,Conus),广泛分布于热带海域,全世界约有750种。在我国南海及台湾海峡,已发现70余种。根据食性,可将芋螺分为食鱼类(Piscivorous)、食虫类(Vermivorous)及食软体动物类(Molluscivorous)。芋螺毒素(Conotoxins,或芋螺多肽(Conopeptides))由芋螺毒腺及毒腺管分泌,组成复杂,每种芋螺的毒液可存在超过100种不同的芋螺多肽。目前已发现芋螺多肽对多种重要的分子靶标具有高结合活性及选择性,包括钠、钾、钙等离子通道,烟碱型乙酰胆碱受体,谷氨酸能受体等多种神经递质受体,G蛋白偶联受体等。由于上述特性,芋螺多肽可以作为神经生物学的研究工具,也可直接发展成药物。钙离子通道广泛存在于哺乳动物的可兴奋细胞中,调节Ca2+电流,参与许多重要的生理过程,如肌肉的兴奋-收缩偶联过程、激素的分泌与调控、神经递质的释放、伤害性疼痛传导等。N-型电压门控钙离子通道(Neural Voltage-gated Calcium Channel,N-VGCC,CaV2.2)属于高压激活钙离子通道,主要分布在中枢和外周神经系统的突触前神经末梢,在神经递质(如:谷氨酸、P物质、CGRP等)的释放过程中起关键作用,是治疗病理性慢性疼痛、炎症疼痛的重要靶点。目前已发现一系列ω-芋螺多肽可抑制CaV2.2活性。ω-MVIIA(Ziconotide)已于2004年由美国FDA批准上市,适用于顽固性非癌症疼、癌症疼及艾滋病相关疼,该药治疗窗狭窄,仅能鞘内给药,且存在较严重的副作用。之后发现的ω-CVID(Leconotide)比ω-MVIIA的副作用小,静脉给药ω-CVID可缓解痛觉增敏,但未见后续临床试验报导。ω-CVIE和ω-CVIF是最近发现的CaV2.2抑制剂,能可逆地抑制初级传入神经到脊髓背角浅层神经元的兴奋性突触传递。本实验室发现的ω-芋螺多肽SO-3对CaV2.2有很强的抑制活性和选择性,镇痛作用与ω-MVIIA相当,但毒副作用较低,目前已完成临床前试验。?-芋螺多肽是目前已知的最小的一类芋螺多肽,通常仅含有12-19个氨基酸残基,其中包括两对二硫键,二硫键的连接方式通常是Cys1-Cys3,Cys2-Cys4。大部分?-芋螺多肽作用于烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR),最近发现一类?-芋螺多肽,如AuIB、RgIA、Vc1.1、Pe IA,也具有CaV2.2抑制活性。此类芋螺多肽可在胞外与γ-氨基丁酸B型受体(GABABR)结合,使GABABR的胞内部分释放G蛋白G?γ亚基。G?γ亚基可与CaV2.2的α1亚基相互作用,减弱CaV2.2的激活电流及去活化电流。此类芋螺多肽中,Vc1.1在动物模型中表现出良好的镇痛作用,但在临床II期试验中发现对人的亲和力较差,由于药效不佳而中止临床试验。环化的Vc1.1可以口服给药,且仍有镇痛效果。该类多肽因序列短、易合成、毒性低、给药方式简便,具有很高的药用前景。本课题组前期除发现特异作用于cav2.2的ω-芋螺多肽so-3外,还开展了?-芋螺多肽的发现、合成、靶点鉴定及药物发展研究。应用基因克隆方法,获得了一系列新?-芋螺多肽序列。在中国南海芋螺黑星芋螺(conusebraeus)、小牛芋螺(conusvitulinus)中发现的eb1.6及vt1.27,分别含16及17个氨基酸,均含两对二硫键。前期澳大利亚合作实验室的靶点研究表明,该两种芋螺多肽对cav2.2的ica均有一定抑制效果,这是首次发现?-芋螺多肽可直接作用于cav2.2。本论文在前期初步工作基础上,开展该两个芋螺多肽cav2.2的结构-活性关系研究,并将ω-芋螺多肽so-3、mviia的关键作用区域引入eb1.6及vt1.27,设计合成嵌合肽,以探索获得新的cav2.2抑制剂,为研发序列短、活性高、毒性低的新型cav2.2抑制剂奠定基础。本论文的主要研究结果如下:(1)成功建立了全细胞膜片钳测定cav2.2的技术平台。扩增了cav2.2及其辅助亚基的质粒,成功的在hek293细胞中功能表达cav2.2通道,完成了全细胞膜片钳设备的调试及cav2.2通道抑制活性测定方法的建立。(2)芋螺多肽eb1.6及突变体对cav2.2抑制活性较低。10μm浓度的eb1.6对cav2.2的抑制活性为28.96±8.84%。参照vt1.27对pro13、asn14进行改造后,10μm浓度的突变体抑制活性下降。pro13被asn或gln取代后,eb1.6[p13n]及eb.16[p13q]的抑制活性分别为10.87±2.37%及13.32±3.16%。asn14突变为带负电荷的asp或glu,eb1.6[n14d]及eb1.6[n14e]的抑制活性分别为3.37±2.61%及5.80±1.89%。asn14被疏水性氨基酸phe或leu替代后活性亦下降,eb1.6[n14f]及eb1.6[n14l]的抑制活性分别为14.09±2.96%及15.93±4.49%。该工作表明pro13和asn14是eb1.6与cav2.2作用的关键氨基酸。(3)芋螺多肽vt1.27对cav2.2的抑制活性略高于eb1.6,10μm抑制率为34.52±9.45%。his6被ala或pro取代、ile10被asn取代后,活性变化不明显,如vt1.27[h6a]、vt1.27[h6p,p9a]及vt1.27[i10n]的抑制活性分别为32.01±8.29%、30.33±6.03%及29.01±4.68%。其余突变体的抑制活性降低,如vt1.27[d11a]、vt1.27[y12a]、vt1.27[r14a]、vt1.27[f15a]、vt1.27[i10d,d11i]等,对cav2.2的抑制活性在11.20±2.76%~24.19±8.29%之间。上述结果表明asp11,tyr12及arg14是vt1.27与cav2.2作用的关键氨基酸。(4)基于分子计算,以so-3或mviialoop2区取代eb1.6、vt1.27的loop2区,并结合so-3的n-端及c-端碱性序列,共设计合成了11个eb1.6、vt1.27与so-3或mviia的嵌合肽。其中,2个eb1.6嵌合肽(10μm)的抑制活性分别为14.46±5.46%、7.45±4.69%,活性低于eb1.6。9个vt1.27嵌合肽(10μm)的抑制活性为18.74±4.24%~36.86±6.72%。将vt1.27的met4替换为lys,his6替换为arg,并以mviialoop2区取代vt1.27原有loop2,且在loop2尾部增加一个Gly后的嵌合肽具有最好的活性,抑制活性为36.86±6.72%。但单独用MVIIA或SO-3的loop2替换Vt1.27的loop2后活性下降,说明两者不能完全互换,然而该loop2稍增长可改善对CaV2.2的抑制活性。
【关键词】：α-芋螺多肽 N-型电压门控钙离子通道 抑制剂 结构活性关系 嵌合肽
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;R91;R914.5
【目录】：

• 缩略词表6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 第一章 前言14-23
• 1.1 引言14
• 1.2 电压依赖的钙通道分类及功能14-15
• 1.3 CaV2.2 的结构基础及相关信号传导15-18
• 1.3.1 CaV2.2 a1 亚基的结构基础15-16
• 1.3.2 CaV2.2 辅助亚基的结构基础16-17
• 1.3.3 CaV2.2 的生理学及病理生理学功能17-18
• 1.4 CaV2.2 抑制剂18-22
• 1.4.1 芋螺多肽类CaV2.2 抑制剂18-19
• 1.4.2 其他动物毒素类CaV2.2 抑制剂19-20
• 1.4.3 小分子类CaV2.2 抑制剂20-22
• 1.5 本课题的研究内容、目的及意义22-23
• 第二章 Eb1.6 的结构-活性关系研究23-37
• 2.1 引言23
• 2.2 实验主要仪器与耗材23-26
• 2.2.1 主要仪器23-24
• 2.2.2 材料及试剂24-26
• 2.3 实验方法26-30
• 2.3.1 芋螺多肽制备26-27
• 2.3.2 膜片钳方法测定多肽对钙离子通道的抑制活性27-30
• 2.3.3 分子对接模拟30
• 2.4 实验结果30-35
• 2.4.1 Eb1.6 及其突变体的合成、折叠、富集及纯化30-33
• 2.4.2 Eb1.6 及其突变体对CaV2.2 的抑制活性33-35
• 2.5 讨论35-36
• 2.5.1 Eb1.6 及其突变体的制备35
• 2.5.2 Eb1.6 的结构-活性关系35-36
• 2.5.3 测定方法对抑制活性结果的影响36
• 2.6 小结36-37
• 第三章 Vt1.27的结构-活性关系研究37-44
• 3.1 引言37
• 3.2 实验主要仪器与耗材37
• 3.3 实验方法37-38
• 3.4 实验结果38-42
• 3.4.1 Vt1.27及其突变体的合成、折叠、富集及纯化38-40
• 3.4.2 Vt1.27及其突变体对CaV2.2 的抑制活性40-42
• 3.5 讨论42-43
• 3.5.1 Vt1.27及其突变体的制备42
• 3.5.2 Vt1.27的结构-活性关系42-43
• 3.5.3 Vt1.27及其突变体与CaV2.2 相互作用模式43
• 3.6 小结43-44
• 第四章 作用于CaV2.2 的嵌合肽设计、合成及活性测定44-54
• 4.1 引言44-45
• 4.2 实验主要仪器与耗材45
• 4.3 实验方法45
• 4.4 实验结果45-51
• 4.4.1 两类嵌合肽的合成、折叠、富集及纯化45-47
• 4.4.2 第一类嵌合肽对CaV2.2 的抑制活性47-49
• 4.4.3 第二类及其他嵌合肽对CaV2.2 抑制活性49-51
• 4.5 讨论51-53
• 4.5.1 嵌合肽的制备51-52
• 4.5.2 嵌合肽抑制活性比较52
• 4.5.3 嵌合肽与CaV2.2 相互作用模式52-53
• 4.6 小结53-54
• 第五章 总结54-56
• 参考文献56-64
• 附录I 本论文涉及多肽的HPLC/MS分析图谱64-73
• 附录II 主要溶液配制73-74
• 附录III 新发现芋螺多肽对CaV2.2 抑制活性的筛选74-79
• 1. 引言74
• 2. 主要实验仪器及耗材74
• 3. 实验方法74
• 4. 实验结果74-79
• 个人简历79-80
• 致谢80

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本文编号：993390