雄性生殖细胞特异性表达GFP小鼠的制备及其在生殖毒性研究中的应用

发布时间：2018-03-10 03:09

  本文选题：雄性生殖毒性　切入点：绿色荧光蛋白　出处：《吉林大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目前,环境化合物、药物、毒物中有许多外源化学物质对动物及人类的雄性生殖系统具有潜在的危害,动物模型可以代替人类评估这些物质对雄性生殖系统的损伤作用。传统的雄性生殖毒理学实验投入成本大、用时时间长、受试动物多、不能在体实时动态观察到生殖系统的损伤。理想的动物模型和先进的实验技术有助于克服传统雄性生殖毒理学实验的缺点。荧光报告蛋白发现于60年代,作为分子标签被广泛应用于研究细胞和分子的功能及相互作用。近几年,荧光报告蛋白的活体荧光体内成像技术迅速发展,特别是具有诸多优点的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP),其在较为简单的成像系统下即可完成体内成像。绿色荧光蛋白(GFP)是否可用于生殖毒物活体筛选与毒性评估呢?目前相关研究报道较少。本课题的主要研究内容是利用Cre-lox P基因重组系统制作雄性生殖细胞特异性表达GFP小鼠模型。利用常见的雄性生殖系统毒物乙二醇单甲醚(Ethylene glycol monomethyl ether,EGME)对此模型小鼠进行染毒处理。以睾丸组织绿色荧光强度作为毒性观察指标,并与常规毒理学指标进行比较,以探讨模型小鼠在雄性生殖毒理学的应用。1、F1代雄性小鼠基因型鉴定生殖细胞特异性表达Cre酶转基因雄鼠(Ddx4-Cre,杂合子—T/W)与具有lox P序列的双荧光报告转基因雌鼠(Rosa26m T/m G,纯合子—mut/mut)交配获得F1代雄性小鼠,其进行基因鉴定后可分成两种基因型:cre(T/W);m T/m G(mut/wt)—双转基因小鼠和cre(W/W);m T/m G(mut/wt)—单转基因小鼠。2、F1代雄性小鼠表型鉴定对这两种不同基因型的F1代雄性小鼠进行表型研究。基因检测发现双转基因F1代小鼠的生殖细胞特异性的发生了Cre酶介导的lox P序列间基因重组;利用小动物成像仪观察组织荧光发现GFP特异性表达在双转基因小鼠睾丸组织;组织冰冻切片的DAPI染色和精子荧光观察结果显示双转基因F1代小鼠睾丸组织中绿色荧光蛋白主要表达在生精小管,集中在精母细胞、精子细胞和精子中。因此雄性生殖系统特异性表达GFP小鼠模型制作成功。3、雄性生殖细胞特异性表达GFP小鼠的EGME染毒实验SPF级雄性生殖细胞特异性表达GFP小鼠8~9周,20只,按照体重随机分成2组,分别设为用药组和对照组。采用灌胃方式进行染毒,用药组小鼠按0.1ml/10g的剂量给予25mg/ml EGME溶液,对照组给予相同剂量的生理盐水。两组动物染毒后分两个阶段—用药11天和用药34天,从活体器官、离体组织和细胞水平观察小鼠睾丸绿色荧光强度变化并进行常规毒理学实验指标的采集。常规的毒理学指标显示:用药组小鼠睾丸重量与对照组小鼠睾丸重量相比明显减小;睾丸组织HE染色观察显示用药11天时小鼠精母细胞大量减少,用药34天时小鼠的精母细胞和精子细胞基本消失,同时睾丸正常结构被破坏。观察睾丸荧光强度结果显示:活体睾丸绿色荧光在用药34天时基本消失;用药11天与用药34天小鼠离体睾丸的荧光强度均低于对照组;因GFP主要表达在睾丸中的精母细胞和精子细胞,这在器官水平上就说明了乙二醇单甲醚可能影响了小鼠睾丸细胞中的精母细胞和精子细胞;睾丸组织切片荧光观察显示在用药11天时小鼠睾丸组织中精母细胞的绿色荧光基本消失,而在靠近生精小管管腔部位的精子细胞中仍然可以观察到绿色荧光,在用药34天时小鼠的精母细胞和精子细胞中绿色荧光均消失,这说明精母细胞是EGME的靶细胞。睾丸绿色荧光观察结果与睾丸重量检测和病理学观察结果相符。利用Cre-lox P系统成功制备了雄性生殖细胞特异性表达GFP小鼠模型,并用EGME给予验证。此模型小鼠可以在器官水平上观察毒性作用的靶细胞,能实时动态的观察生殖系统的变化,可减少实验动物使用量、缩短试验时间,为开发雄性生殖毒理学研究中的动物模型和实验技术奠定基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114

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本文编号：1591484