胚胎植入期二硫化碳暴露对孕鼠子宫内膜细胞DNA损伤与白血病抑制因子基因完整性的影响

发布时间：2018-04-11 20:39

本文选题：硫化碳 + 胚胎毒性　；参考：《山东大学》2013年硕士论文

【摘要】：研究背景二硫化碳(Carbon disulfide, CS2)是一种工业上常用的有机溶剂和重要的化工生产原料,主要用于粘胶纤维(又称人造丝)的生产。在生产过程中,CS2常因易挥发而扩散到工作环境中,对暴露在其中的工人造成多器官损害,而且CS2的从业人员中以女工为主。本课题组前期研究结果发现,胚胎植入期暴露于不同剂量的CS2均可导致小鼠胚胎植入数目的明显减少,同时均能导致子宫内膜细胞的DNA损伤,并呈现出明显的剂量反应关系。在生物体内存在DNA的损伤修复功能,它对生物的生存和遗传稳定性的维持至关重要。目前,胚胎植入期CS2暴露后孕鼠子宫内膜细胞DNA损伤的时间变化规律尚不明确。因此本研究拟通过检测胚胎植入期CS2暴露后小鼠子宫内膜细胞DNA损伤的变化情况,探讨CS2暴露对子宫内膜细胞DNA损伤的时效性影响,为在基因水平上揭示胚胎植入期CS2暴露致胚胎毒性的机制提供理论依据,同时为探讨胚胎植入期CS2暴露对孕鼠子宫内膜细胞白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF)基因完整性的影响提供前提条件。前期实验结果还发现,胚胎植入期CS2暴露导致的胚胎植入数目减少与子宫内内膜相关粘附分了(特别是作为胚胎植入标志性分了LIF)的蛋白和mRNA表达水平的降低有关,但CS2暴露致LIF蛋白及mRNA表达水平降低的机制尚不明确。彗星荧光原位杂交技术(Comet assay combined with fluorescence in situ hybridization, Comet-FISH)是彗星实验和荧光原位杂交技术的结合,是一种在单细胞水平检测特定基因损伤和修复的有效方法,目前主要应用于遗传毒物对抑癌基因TP53影响的研究中。本研究拟通过采用该技术来检测胚胎植入期CS2暴露对小鼠子宫内膜细胞LIF基因完整性的影响,从而在基因水平上揭示CS2暴露致LIF蛋白及mRNA表达水平降低的机制,并从DNA水平解释胚胎植入期CS2暴露致胚胎植入数目减少的原因。研究目的构建胚胎植入期不同时点暴露与CS2的动物模型,观察不同时点CS2暴露对孕鼠母体及胚胎的影响；检测敏感暴露时点的不同观察终点孕鼠子宫内膜细胞DNA损伤的时间变化规律,并检测各观察终点LIF基因的断裂情况,以期在DNA水平上探讨胚胎植入期CS2暴露致胚胎植入数目减少的机制。研究方法 1.建立动物模型 SPF级性成熟昆明种小鼠适应性喂养一周后,按雌雄1：1交配合笼,次日晨8点检查阴栓,阴栓阳性者记为孕第1天(GD1)。将孕鼠随机分为8个组：4个暴露组{4种暴露时间，即受孕后第3天(GD3)、第4天(GD4)、第5天(GD5)和第6天(GD6)}和4个相应的对照组，各有12只孕鼠。按631.4mg/kg(0.4LD50)的剂量在设定的暴露时点给予孕鼠一次性腹腔注射CS2溶液,对照组给予等体积的橄榄油。各组孕鼠均于受孕后第9天脱臼处死,称取子宫、卵巢、肝、脾、肾、胚胎等的重量,并计数胚胎植入数目。在上述动物模型中选定胚胎植入数目减少最明显的暴露时间作为机制研究的暴露时点。将孕鼠随机分为14个组：CS2暴露组和溶剂对照分别包括7个观察时点(即暴露后6h、12h、18h、24h、2d、3d和5d)组。暴露剂量和溶剂同前。 2.子宫内膜细胞的收集在每个观察时点将孕鼠脱臼处死,采用机械刮取法直接刮取孕鼠子宫内膜,反复吹打制成单细胞,计数细胞存活率并调整细胞密度至2×105～4×105个/ml。 3.检测孕鼠子宫内膜细胞DNA损伤建立适用于检测小鼠子宫内膜细胞损伤的彗星实验条件和方法,检测CS2暴露后各观察时点孕鼠子宫内膜细胞DNA损伤情况。 4.检测孕鼠子宫内膜细胞LIF基因断裂情况订制与LIF基因相结合的荧光标记探针,采用Comet-FISH实验技术检测CS2暴露后各观察时点孕鼠子宫内膜细胞LIF基因断裂情况。 5.统计分析方法采用Excel建立数据库,使用SPSS16.0进行统计分析,测量指标均以x±s表示。各组指标之间首先进行方差齐性检验；若方差齐,采用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)进行F检验,差异有显著性时采用Dunnett-t test进行暴露组与对照组均数差异的显著性检验；若方差不齐,采用非参数统计Kruskal-Wallis Test进行组间比较,Mann-Whitney Test进行两两比较。统计学检验水准设定为a=0.05。研究结果 1.胚胎植入期CS2暴露对孕鼠母体及胚胎的毒性作用母体毒性：孕鼠在胚胎植入期不同时点暴露于CS2,各暴露组孕鼠的GD9体重和体重增重与对照组相比,差异均没有统计学意义。与对照组相比,各暴露组孕鼠子宫、卵巢、肝脏、脾脏及肾脏重量均无统计学差异,各暴露组孕鼠的肝脏、脾脏及肾脏系数也没有统计学意差异；而GD4暴露组的子宫系数和GD5暴露组的卵巢系数与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05)。此结果提示,胚胎植入期暴露于CS2对孕鼠的生殖器官有一定的影响,具有一定的生殖毒性。胚胎毒性：GD4和GD5暴露组的胚胎植入数目和胚胎窝重与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05),GD4和GD5暴露组的胚胎植入数目较对照组分别减少了93.65%和90.44%,胚胎窝重也明显低于对照组,但校正胚胎植入数目后胚胎均重与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。 2.胚胎植入期CS2暴露对孕鼠子宫内膜细胞DNA损伤的影响 GD4孕鼠暴露于CS2,在暴露后的6h、12h、18h、24h和2d,反映孕鼠子宫内膜细胞DNA损伤的各项指标(TDNA%、TL、TM和OTM)与对照组相比,均有统计学意义(P0.05)。CS2暴露后的18h其DNA损伤程度最明显,且TDNA%、TL、TM和OTM与胚胎植入数目之间存在相关性,相关性系数r分别为-0.863、-0.934、-0.804和-0.847,且均具有统计学意义(P0.01)。在暴露后的3d和5d,孕鼠子宫内膜细胞的DNA损伤情况对对照组相比均没有统计学差异。 3.胚胎植入期CS2暴露对孕鼠子宫内膜细胞LIF基因完整性的影响 GD4孕鼠暴露于CS2,应用Comet-FISH技术检测与LIF基因相结合的荧光标记探针信号。除暴露后18h以外,各观察时点检测到的荧光信号均出现在彗星头部,但暴露后18h在彗星尾部检测到荧光信号，说明暴露于CS2后可导致子宫内膜细胞LIF基因发生断裂。结论 1.胚胎植入期CS2暴露可导致明显的胚胎毒性,主要表现为胚胎植入数目明显减少,而且GD4是胚胎植入期CS2暴露致胚胎毒性的敏感时点。 2.DNA损伤是胚胎植入障碍的重要机制之一。GD4孕鼠暴露于CS2后至18h内DNA损伤程度逐渐增强,18h时达到最高值；18h后DNA损伤程度逐渐恢复到正常水平,子宫内膜细胞DNA损伤呈现出明显的时间变化规律。此外,DNA损伤程度与胚胎植入数目之间存在明显的负相关关系。 3.CS2暴露后18h是LIF基因损伤的敏感时点。在CS2暴露后18h的孕鼠子宫内膜细胞中发现LIE基因断裂，且暴露后18hDNA损伤最为明显。这可能是导致GD4暴露LIF mRNA和蛋白表达水平均降低的重要原因之一。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R114

【参考文献】