甲醛对BM-MSCs的毒性作用及相关机制研究

发布时间：2018-04-15 17:23

本文选题：甲醛 + BM-MSCs　；参考：《甘肃农业大学》2014年博士论文

【摘要】：研究背景和目的：甲醛（formaldehyde）是A1类致癌物质，可以导致白血病的发生，但是生物学证据不足。已有研究证实甲醛对骨髓中的造血干细胞具有毒性影响，然而对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）的毒性作用，还未见报道。BM-MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞，不仅具有多向分化潜能，还能调节造血干细胞的正常增殖和分化。因此，BM-MSCs一旦受损，就会影响骨髓的正常造血，从而导致白血病的发生。本研究检测甲醛对BM-MSCs的细胞毒性、遗传毒性、细胞周期和凋亡影响，并试图阐明其分子机制，从而为甲醛导致白血病的发生提供生物学依据。方法：本研究采用噻唑蓝比色法[3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-2-y1)-2,5-diphenytetrazo-liumromide, MTT]研究甲醛对BM-MSCs的增殖活性影响；用彗星（comet assay）、KCl-SDS沉淀、姐妹染色单体互换（Sister chromatid exchange,SCE）、微核（Micronucleus, MN）实验检测甲醛对BM-MSCs的DNA损伤效应；并应用RT2profiler PCR array分析DNA损伤信号通路重要基因的表达改变情况；采用流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察鬼笔环肽（phalloidine）/hoechst33258双染细胞的结果，分析甲醛对BM-MSCs细胞周期和凋亡的影响，并用蛋白免疫印迹（westernblot）法检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达情况。结果：（1）75~200μmol/L甲醛可以抑制BM-MSCs的增殖（P0.01），并呈剂量依赖关系，而无明显的时间依赖关系。（2）标准的碱性彗星实验结果显示，75~200μmol/L甲醛诱导BM-MSCsDNA断裂效应呈现先增高后降低趋势，在125μmol/L时，达到峰值，其中75~150μmol/L甲醛作用与对照组比有统计学意义（P0.01）；蛋白酶K修饰的彗星实验结果显示，75~200μmol/L甲醛诱导DNA断裂效应逐渐上升呈剂量依赖关系（P0.01）。另外，蛋白酶K修饰的彗星实验OTM值比标准彗星实验的OTM值高，且在大于125μmol/L时，差异具有统计学意义（P0.01）。（3）甲醛在≥125μmol/L时可以明显引起BM-MSCs DNA-蛋白交联（DNA-protein crosslinks, DPCs）、SCE，在≥150μmol/L时可以明显引起MN的形成，与对照组相比，P值均0.01。（4）NER修复通路上的Xpa和Xpc，HR修复通路上的Brca2，Rad51和Xrcc2基因在75和125μmol/L甲醛作用时，与对照组相比，表达上调2倍以上，然而这些基因在175μmol/L甲醛作用时表达却均下调2倍以上。还有细胞周期调控基因Chk1和Hus1在75，125和175μmol/L甲醛作用时表达一致，均上调超过2倍。（5）随着甲醛浓度的增高，G2期细胞百分数逐渐增加，在≥125μmol/L时，与对照组相比，，有统计学意义（P0.01）。（6）随着甲醛浓度的增高，BM-MSCs细胞体积逐渐缩小，细胞骨架排列出现紊乱，细胞核浓缩、深染并出现分裂，形成凋亡小体，在≥125μmol/L时，凋亡率明显增高（P0.01）。（7）P53、ERK1/2蛋白在75，125，175μmol/L甲醛作用时，相对光密度值与对照组相比无明显差别（P0.05）； p-P53、Chk1和Bax蛋白在75，125，175μmol/L甲醛作用时，相对光密度值呈逐渐升高趋势，且与对照组相比有显著差别（P0.05）；p-ERK1/2蛋白在75，125，175μmol/L甲醛作用时，Bcl-2蛋白在125，175μmol/L甲醛作用时，相对光密度值呈下降趋势，与对照组比差异有统计学意义（P0.05）。结论：（1）甲醛对BM-MSCs具有细胞毒性和遗传毒性，为研究甲醛导致白血病的发生提供了生物学依据。（2）甲醛可以诱导BM-MSCs DNA链发生断裂，并且呈剂量依赖关系；还可以诱导DPCs、SCE、MN的形成。（3）甲醛使BM-MSCs细胞周期阻滞在G2期；并在较高浓度时（≥125μmol/L）引起BM-MSCs凋亡。（4）NER通路上的Xpa，Xpc；HR通路上的Brca2，Rad51，Xrcc2可能参与了甲醛诱导的BM-MSCs DNA损伤的修复。（5）P53、Chk1、ERK1/2、Bax和Bcl-2共同参与了甲醛诱导BM-MSCs的G2期周期阻滞和细胞凋亡。（6）蛋白酶K修饰的彗星实验可作为一种更为敏感的方法来检测甲醛导致的DNA链断裂效应。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114

【参考文献】