n-3 PUFAs抑制高脂肪饮食小鼠肠肿瘤形成作用及机制研究

发布时间：2018-10-23 07:51

【摘要】：目的:以能够内源性合成n-3多不饱和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3PUFAs)的fat-1转基因小鼠及野生型(wild type,WT)C57BL/6J小鼠为研究对象,腹腔注射致癌剂氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)诱导结肠肿瘤。对比高脂肪饮食(high fat diet,HFD)和正常饮食(normal fat diet,NFD)的野生型小鼠的结肠肿瘤负荷的不同,以及对比高脂肪饮食的野生型小鼠和fat-1转基因小鼠的结肠肿瘤负荷的差异,明确高脂肪饮食促进致癌剂诱导的肠肿瘤形成和n-3 PUFAs抑制肠肿瘤形成作用。检测结肠组织炎症相关基因表达,检测n-3 PUFAs---二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)对巨噬细胞表型和结肠细胞HT-29炎症通路的影响,综合分析n-3 PUFAs抑制肠肿瘤作用机制。方法:(1)实验小鼠分为3组,摄入含10%红花籽油的正常饲料(normal fat diet,NFD)的野生型小鼠组(WT+NFD)、含10%红花籽油和20%猪油的高脂肪饲料(high fat diet,HFD)的野生型小鼠组(WT+HFD)、含10%红花籽油和20%猪油的高脂肪饮食的fat-1转基因小鼠(fat-1+HFD)。10mg/kg′bw AOM腹腔注射,每周一次、持续六次,喂养22周诱导小鼠结肠肿瘤形成。fat-1转基因小鼠的特点是转入了fat-1基因,摄入含n-6 PUFAs丰富的红花籽油、可内源性合成n-3 PUFAs。记录各组小鼠结肠肿瘤数量,计算肿瘤发生率和肿瘤负担。取远端结肠组织行组织病理学分析,气相色谱法检测脂肪酸含量,免疫组化法检测PCNA水平以对结肠细胞的增殖情况进行鉴定,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RTPCR)法检测结肠组织炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、癌基因c-myc、巨噬细胞标记物F4/80 mRNA表达水平,蛋白印迹法检测抑癌基因p53、凋亡相关蛋白caspase 3及其活性形式cleaved caspase 3水平,炎症通路相关蛋白p-GSK3β、β-catenin、NF-κB、p-NF-κB、STAT3、p-STAT3、NLRP3水平。(2)以人单核细胞THP1为研究对象,100ng/ml佛波酯(Phorbol 12-myristate13-acetate,PMA)诱导THP1细胞分化为M0型巨噬细胞。不同浓度DHA(0-40μM)预处理M0巨噬细胞24h后,100ng/ml脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激M0型巨噬细胞18h,q RT-PCR法检测巨噬细胞(M0)IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表达水平。100ng/ml LPS、50ng/ml IFN-γ联合孵育M0型巨噬细胞诱导分化成M1型巨噬细胞,不同浓度DHA孵育M1型巨噬细胞。q RT-PCR法检测M1型巨噬细胞细胞标记物IL-6、TNF-α、IL-1β、CCR7 mRNA水平和M2型巨噬细胞标记物CCL4、CD206 mRNA水平。(3)以人结肠癌细胞HT-29为研究对象,50ng/ml TNF-α处理HT-29细胞1h,q RT-PCR和蛋白印迹法分别检测IL-8、IL-1β,蛋白印迹法检测胞浆和胞核炎症通路蛋白NF-κB、p-NF-κB和细胞内ERK1/2、p38MAPK、JNK、Akt及其磷酸化水平。为研究DHA对TNF-α诱导HT-29细胞NF-κB活化的影响,不同浓度DHA预孵育HT-29细胞24 h后,50ng/ml TNF-α处理HT-29细胞1 h,qRT-PCR检测IL-8 mRNA,蛋白印迹法检测IL-1β和ERK1/2、p38MAPK、JNK、Akt及其磷酸化蛋白,以及胞浆和胞核中NF-κB、p-NF-κB水平。结果:(1)WT+HFD组小鼠结肠肿瘤负荷高于WT+NFD组,而fat-1+HFD组则低于WT+HFD。根据气相色谱结果,野生型小鼠结肠组织n-6/n-3 PUFAs比值明显高于fat-1小鼠。qRT-PCR分析表明,WT+HFD组结肠组织炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β明显高于WT+NFD和fat-1+HFD组。蛋白印迹结果显示,WT+HFD组pGSK3β、β-catenin、NF-κB、p-NF-κB、p-STAT3、NLRP3等炎症通路蛋白表达明显高于WT+NFD小鼠和fat-1+HFD小鼠。免疫组化检测发现,WT+HFD组小鼠PCNA表达高于WT+NFD组和fat-1+HFD组。蛋白印迹分析显示,WT+HFD组结肠组织凋亡相关蛋白caspase 3活性形式cleaved caspase 3水平明显低于WT+NFD和fat-1+HFD组。qRT-PCR结果表明,WT+HFD小鼠癌基因c-myc mRNA水平明显高于WT+NFD小鼠和fat-1+HFD小鼠。(2)细胞实验结果显示,DHA降低巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA水平,抑制M1型巨噬细胞标记物TNF-α、IL-1β、IL-6、CCR7 mRNA表达,增强M2型标记物CCL4 mRNA表达。(3)DHA抑制TNF-α处理的结肠HT-29细胞炎症因子IL-1β、IL-8表达及其ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、Akt、p-Akt表达,抑制NF-κB的活化。结论:(1)高脂肪饮食上调TNF-α/NF-κB和IL-6/STAT3、GSK3β/β-catenin/c-myc炎症信号通路、促进NLRP3炎症小体的形成、增加AOM诱导的小鼠肠肿瘤发生。(2)n-3 PUFAs降低小鼠肠组织TNF-α/NF-κB和IL-6/STAT3炎症通路相关蛋白表达、抑制NLRP3表达、拮抗高脂肪饮食小鼠结肠肿瘤形成。(3)n-3 PUFAs(DHA)抑制巨噬细胞炎症因子产生、诱导巨噬细胞表型向M2型转变。(4)n-3 PUFAs(DHA)下调Akt和MAPK信号通路、抑制TNF-α刺激HT-29细胞NF-κB的活化。综上,n-3 PUFAs可抑制高脂肪饮食小鼠结肠肿瘤的发生,该作用与抑制炎症信号通路、诱导巨噬细胞表型向M2转变有关。
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【学位授予单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R151

【参考文献】