【摘要】：矽肺(silicosis)是在生产过程中长期吸入含有游离二氧化硅的粉尘,引起的一种以肺组织弥漫性纤维化为主的全身性疾病,一直是我国影响面最广泛、危害最严重的职业病之一。研究表明,矽尘进入机体后可激活巨噬细胞,使其分泌大量促炎和促纤维化因子,诱导炎症反应发生,促使成纤维细胞过度增殖,分泌包含胶原蛋白、层粘连蛋白和纤粘蛋白在内的细胞外基质,最终导致肺纤维化发生。近年来发现矽尘能损伤肺泡上皮细胞,引起上皮细胞间质转化(EMT),增加细胞外基质的沉积。矽肺病因明确,但发病机制复杂,至今仍未完全揭示其确切的分子机制,制约了治疗上的突破。因此,探明矽肺病发生发展的分子机制是解决矽肺治疗难题的重要基础。大量关于哺乳动物转录组研究已经揭示数以万计的序列被转录为转录本(大约占87.3%)。然而,仅有不到3%的序列产生的转录本是编码蛋白质的,大多数转录本并没有翻译为蛋白质,它们在RNA水平上行使各自的生物学作用,在发育和基因表达中发挥着复杂精确的调控功能,称之为非编码RNA(ncRNA),包括 microRNA、lncRNA、siRNA、piRNA、snoRNA 等。microRNA(miRNA)主要与靶基因 mRNA3'非翻译区(3'-UTR)的 miRNA反应元件(MREs)通过碱基序列互补特异性结合,抑制靶基因蛋白质翻译或促进其降解,从而调控靶基因的表达。研究发现不少的miRNAs通过作用多个靶基因、影响多条信号通路调控肺纤维化的发生发展。但有关miRNAs调控矽尘诱导肺纤维化的研究报道还比较少。我们前期miRNA芯片筛检发现miR-489在小鼠矽肺模型不同时间点的肺组织中表达均降低,在进一步的动物实验中得到证实。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)转录本长度超过200 nt,本身并不编码蛋白,能在表观遗传、转录及转录后水平上调控基因的表达。研究发现lncRNAs可调控心血管、神经系统和器官纤维化等疾病的发生发展过程。目前,lncRNAs调控肺纤维化的研究报道还较少,且主要集中于博来霉素诱导的肺纤维化。在矽尘诱导的肺纤维化发生发展中,lncRNAs是否也发挥重要的调控作用,还有待深入研究。文献报道在心肌肥厚疾病的病理过程中,lncRNA CHRF可调控miR-489 水平。因此,本研究将探讨miR-489在矽尘诱导肺纤维化中的作用及潜在分子机制,在此基础上将深入研究lncRNA CHRF是否也可以调控miR-489的表达,从而影响矽尘诱导肺纤维化的进程,并阐明其潜在的调控机制。目的在整体动物水平通过上调小鼠体内miR-489表达,明确miR-489对矽尘诱导肺纤维化的影响;在细胞水平构建矽尘诱导的巨噬细胞模型和TGF-β1诱导的成纤维细胞模型来探讨lncRNA CHRF、miR-489、炎症信号通路重要分子MyD88及TGF-β信号通路重要分子Smad3之间的调控关系,最终阐明lncRNA CHRF吸附miR-489调控炎症和纤维化两条信号通路影响矽尘诱导的肺纤维化,为矽肺病新的治疗靶点提供科学依据。方法构建矽尘诱导小鼠肺纤维化模型,qRT-PCR方法检测染尘后7、14和28天小鼠肺组织中miR-489 水平。尾静脉注射miR-489模拟物(agomir)干预矽尘诱导的小鼠肺纤维化,分析肺组织病理改变,Western Blot方法检测肺组织炎症和纤维化标志物水平。采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-489与靶基因MyD88和Smad3的结合。采用矽尘处理巨噬细胞(RAW264.7、THP-1)及TGF-β1处理成纤维细胞(NIH/3T3、MRC-5)后观察 miR-489、MyD88、Smad3、p-Smad3、炎症和纤维化标志物的表达水平。采用miR-489 mimic、靶基因siRNA分别转染或miR-489 mimic与靶基因过表达质粒共转染矽尘处理巨噬细胞及TGF-β1处理成纤维细胞,观察miR-489对MyD88和Smad3的调控作用。采用荧光原位杂交(FISH)实验观察lncRNACHRF在巨噬细胞和成纤维细胞中的定位,并且运用双荧光素酶报告基因实验和RNA pull down实验验证lncRNA CHRF与miR-489的结合。采用lncRNA CHRF过表达质粒及其siRNA分别转染、lncRNA CHRF过表达质粒与靶基因siRNA共转染、miR-489 mimic与lncRNA CHRF过表达质粒/siRNA共转染到矽尘处理的巨噬细胞及TGF-β1处理的成纤维细胞中,观察lncRNA CHRF吸附miR-489调控MyD88和Smad3对矽尘诱导肺纤维化的影响。结果1.miR-489可减轻矽尘诱导的小鼠肺纤维化基于前期芯片结果,我们选择了 miR-489进行深入研究,首先在后续构建的矽尘诱导肺纤维化模型中验证,结果发现小鼠肺组织中miR-489的表达在矽尘处理后7、14和28天均出现显著降低。因此,我们认为上调miR-489可以减轻矽尘诱导的肺纤维化,并采用miR-489模拟物(agornir)来上调矽尘诱导小鼠体内miR-489水平。28天病理切片的HE染色及纤维化评分结果均显示上调小鼠体内miR-489表达后,矽尘诱导肺纤维化损伤的严重程度和分布范围均明显减轻。同时,Western Blot方法检测也发现上调miR-489后可使小鼠肺组织中间质细胞标志物α-SMA和Vimentin蛋白水平降低,而上皮细胞标志物E-cadherin的蛋白水平得到一定程度恢复。以上结果明确了在整体动物水平上调miR-489可减轻矽尘诱导的肺纤维化。2.miR-489靶向MyD88抑制矽尘诱导肺纤维化初期的炎症反应在明确miR-489可减轻矽尘诱导肺纤维化的基础上,我们通过生物信息学预测方法寻找miR-489的靶基因,结果发现Toll样受体炎症信号通路的关键分子MyD88可能是miR-489的靶基因。随后我们用双荧光素酶报告基因实验验证发现miR-489可降低MyD88野生型荧光素酶活性,对突变型没有影响,这提示miR-489可能通过靶向MyD88抑制矽尘诱导肺纤维化初期的炎症反应。考虑到IL-1β是MyD88下游的关键促炎因子以及巨噬细胞受到矽尘刺激后可释放促纤维化因子TGF-β1,我们认为MyD88表达增加后可促进IL-1β水平升高,激活炎症反应,进而直接或间接促进TGF-β1的释放。因此,我们同时观察了矽尘诱导肺纤维化小鼠肺组织中MyD88、IL-1β和TGF-β1的表达,结果发现这些分子的蛋白表达均增加,并且上调矽尘诱导小鼠体内miR-489水平可明显抑制MyD88、IL-1β和TGF-β1的表达。然后我们用矽尘处理巨噬细胞发现miR-489水平随着矽尘处理浓度的增加逐渐降低,而上调矽尘处理巨噬细胞中miR-489水平后可抑制MyD88、IL-1β和TGF-β1的表达,并且在矽尘处理的巨噬细胞中发现敲低MyD88后IL-1β和TGF-β1蛋白表达也随之降低。最后在巨噬细胞中共转染miR-489模拟物和MyD88过表达质粒发现MyD88可逆转miR-489对炎症反应的抑制作用。因此,我们最终阐明了 miR-489可通过靶向MyD88抑制矽尘诱导肺纤维化初期的炎症反应。3.miR-489靶向Smad3抑制矽尘诱导的肺纤维化进程在运用生物信息学方法寻找miR-489靶基因的过程中,我们发现TGF-β信号通路的关键分子Smad3也可能是miR-489的潜在靶基因。因此,我们进行了双荧光素酶报告基因实验,结果发现miR-489可降低成纤维细胞中Smad3野生型荧光素酶活性,对突变型没有影响,提示miR-489可能通过靶向Smad3抑制矽尘诱导的肺纤维化进程。接着我们先观察到矽尘诱导肺纤维化小鼠肺组织中总Smad3和p-Smad3蛋白表达增加,上调矽尘诱导小鼠体内miR-489水平可明显抑制总Smad3和p-Smad3的表达。随后,我们在TGF-β1处理的成纤维细胞中也观察到miR-489表达降低,而总Smad3、p-Smad3蛋白表达增加,并且纤维化标志物α-SMA和Vimentin蛋白表达也增加。而在TGF-β1处理成纤维细胞中上调miR-489可明显抑制总Smad3和p-Smad3水平,同时也降低α-SMA和Vimentin的表达,并且在TGF-β1处理的成纤维细胞中发现敲低Smad3后可抑制α-SMA和Vimentin的蛋白表达。最后在成纤维细胞中共转染miR-489模拟物和Smad3过表达质粒发现Smad3可逆转miR-489对纤维化反应的抑制作用,最终我们阐明了 miR-489可通过靶向Smad3抑制矽尘诱导的肺纤维化。综合分析,表明miR-489可影响矽尘诱导肺纤维化初期的炎症反应和后续的纤维化进程,miR-489是矽尘诱导肺纤维化重要的负调控者。4.IncRNA CHHRF可负调控miR-489的表达水平随着lncRNAs调控miRNAs的研究逐渐深入,我们在检索miR-489文献时发现在心肌肥厚疾病的病理过程中,lncRNA CHRF可调控miR-489的表达。为了探讨在矽尘诱导的肺纤维化中,lncRNA CHRF是否对miR-489也发挥类似作用,我们首先检测了 lncRNA CHRF的表达水平,结果在矽尘诱导小鼠肺纤维化组织、矽尘处理的巨噬细胞以及TGF-β1处理的成纤维细胞中均观察到lncRNA CHRF的表达明显升高,提示在矽尘诱导的肺纤维化中lncRNA CHRF可能发挥重要作用。随后我们采用FISH实验发现lncRNA CHRF在巨噬细胞和成纤维细胞的细胞核和细胞质中均有分布,并且双荧光素酶报告基因实验及RNApull down实验也验证了 lncRNA CHRF与miR-489的直接结合,表明lncRNA CHRF可以吸附miR-489。为进一步观察lncRNA CHRF对miR-489表达水平的影响,我们在巨噬细胞和成纤维细胞中共转染miR-489 mimic和lncRNA CHRF过表达质粒/siRNA,结果观察到转染lncRNA CHRF过表达质粒可逆转mimic引起的miR-489水平升高,而转染lncRNA CHRF siRNA可进一步促进mimic引起的miR-489水平增加。这些结果提示在矽尘诱导的肺纤维化中,lncRNA CHRF可通过吸附miR-489负调控其表达水平。5.IncRNA CHRF通过吸附miR-489促进矽尘诱导的肺纤维化观察到lncRNA CHRF负调控miR-489表达水平后,我们进一步探讨lncRNA CHRF在矽尘诱导肺纤维化中的功能作用。我们首先观察到在矽尘处理巨噬细胞和TGF-β1处理成纤维细胞中过表达lncRNA CHRF可引起MyD88、Smad3、p-Smad3及炎症和纤维化标志物的蛋白表达增加,并且敲低MyD88和Smad3可阻断lncRNA CHRF过表达引起的这些效应,表明MyD88和Smad3是lncRNA CHRF发挥作用的下游分子。更进一步在矽尘处理巨噬细胞和TGF-β1处理成纤维细胞中敲低lncRNA CHRF可抑制MyD88、Smad3、p-Smad3及炎症和纤维化标志物的蛋白表达,这些结果表明lncRNACHRF可调控MyD88和Smad3,进而促进矽尘诱导的肺纤维化。随后为了观察lncRNA CHRF是否通过吸附miR-489而调控MyD88和Smad3,我们采用miR-489 mimic与lncRNA CHRF过表达质粒/siRNA共转染的方法,结果观察到在矽尘处理巨噬细胞和TGF-β1处理成纤维细胞中,过表达lncRNA CHRF可抵消miR-489对MyD88和Smad3的抑制作用,从而增加 IL-1β、TGF-β1、α-SMA 和 Vimentin 表达,而敲低 lncRNA CHRF 可加强miR-489对MyD88和Smad3的抑制作用,从而降低IL-1β、TGF-β1、α-SMA和Vimentin的表达。综合分析,这些结果表明lncRNA CHRF可通过吸附miR-489调控MyD88和Smad3促进矽尘诱导的肺纤维化。结论本研究在整体动物和细胞水平上明确了 miR-489可减轻矽尘诱导的肺纤维化。机制研究发现:(1)miR-489主要通过调控炎症通路重要分子MyD88和TGF-β通路重要分子Smad3来减轻矽尘诱导的肺纤维化;(2)lncRNA CHRF可吸附miR-489,解除其对靶基因MyD88和Smad3的抑制作用,进而激活炎症和纤维化信号通路,表明 lncRNA CHRF-miR-489-MyD88 和 lncRNA CHRF-miR-489-Smad3信号轴在矽尘诱导肺纤维化中发挥关键作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R135.2
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本文编号：
2326628
