二硫化碳染毒大鼠神经组织中自噬相关蛋白的变化

发布时间：2019-04-11 14:31

【摘要】：研究目的：二硫化碳(carbon disulfide, CS2)是一种常见有机溶剂,广泛应用于人造丝、玻璃纸、杀虫剂、四氯化碳等的生产加工。职业暴露于CS2可引起作业工人神经系统功能损伤,主要表现为周围神经病。本研究利用CS2灌胃染毒建立大鼠中毒性周围神经病模型,透射电镜观察脊髓组织和坐骨神经超微结构的损伤,速率法测定血清中肌酸激酶(CK)活性,Western blotting法检测大鼠脊髓和坐骨神经中自噬相关蛋白及其调控信号蛋白的相对含量,描述CS2中毒性周围神经病大鼠神经组织中自噬蛋白的变化情况,以研究神经元自噬改变与周围神经病的关系,探讨CS2中毒性周围神经病的分子机制。研究方法： 1.建立Wistar大鼠CS2中毒性周围神经病模型健康雄性Wistar大鼠80只,体重280～300g,经适应性饲养7天后随机分为对照组、200、400和600mg/kgCS2染毒组,每组20只。用玉米油作溶剂配制不同浓度CS2溶液,2ml/kg灌胃Wistar大鼠,对照组灌胃等体积的玉米油,6次/周,持续6周。每周两次称量体重,一次测定大鼠前肢、四肢抓力以及甩尾实验时间,每天注意观察大鼠步态、震颤现象并予以记录。染毒结束后,大鼠断头处死,取脊髓、坐骨神经及血清,-80℃保存备用。 2.透射电镜观察脊髓和坐骨神经病理改变染毒终点时,各组分取两只大鼠,乌拉坦麻醉后取坐骨大孔下坐骨神经2-3cm,戊二醛灌注固定后取胸腰段脊髓,取下的坐骨神经及脊髓组织经固定、脱水、包埋、切片、染色后,透射电镜观察、摄片。 3.速率法测定大鼠血清中肌酸激酶(CK)活性使用肌酸激酶测定试剂盒,全自动生化分析仪进行测定,得出各组血清样品中肌酸激酶活性数值。 4Western blotting法测定大鼠脊髓组织和坐骨神经中自噬相关蛋白和信号通路蛋白的相对含量脊髓组织按质量体积比1∶5加入预冷的含有TritonX-100、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的匀浆液；坐骨神经先在液氮中研成粉末,然后按质量体积比1∶5加入上述预冷匀浆液。以上组织在冰水浴中匀速匀浆,4℃20,000×g离心60min。取上清装入Eppendorf管中,经BCA法蛋白定量后,Western blotting法测定自噬相关蛋白和信号通路蛋白的相对含量。研究结果： 1.CS2染毒对大鼠体重的影响：实验过程中,对照组动物体重稳步上升；200、400和600mg/kg CS2染毒组体重分别从第3周、第2周、第2周开始与对照组间差异有统计学意义(P＜0.05),至实验结束,各染毒组大鼠体重分别为对照组的89.6%、78.3%、64.6%,差异均有统计学意义。 2.CS2染毒大鼠亚慢性中毒情况：CS：染毒后,400和600mg/kgCS2组大鼠表现为步态异常,活动减少,肌张力降低,精神状态差等。随染毒剂量的增加,症状逐渐加重。染毒第3周,600mg/kgCS2染毒组步态出现异常(P＜0.05),至实验结束,1/3的动物瘫痪,完全不能支持体重、足后翻、前行困难,被评为4分。染毒第4周,400mg/kgCS2染毒组步态出现异常,至实验结束,1/3动物被评为3分。200mg/kg CS2染毒组整个实验过程中中毒表现不明显。此外,400和600mg/kgCS2染毒组分别于染毒第4周、第3周出现震颤,至实验结束,各组震颤发生比例分别为30%和65%。 3.CS2染毒对大鼠甩尾时间、前肢抓力、四肢抓力的影响：(1)整个实验过程中,染毒动物甩尾时间无明显变化。(2)染毒前3周,各组大鼠前肢抓力呈上升趋势,400和600mg/kgCS2染毒组分别在染毒第5周、第4周呈现下降趋势,至实验结束,与对照组相比,分别下降10.3%、35.5%。染毒第5周、第6周,600mg/kgCS2染毒组前肢抓力与对照组间差异有统计学意义(p＜0.05)。(3)染毒前3周,各组大鼠四肢抓力随体重增加而增加。染毒第4周,600mg/kgCS2组大鼠四肢抓力开始下降,至染毒结束,下降了26.2%。染毒第5、6周,与对照组相比,600mg/kgCS2染毒组大鼠四肢抓力分别降低10.2%,25.7%,差异有统计学意义(P＜0.05)。 4.CS2染毒对大鼠血清中肌酸激酶活性的影响：CS2染毒大鼠血清中肌酸激酶活性显著降低。与对照组相比,200、400和600mg/kgCS2组分别降低了24.8%、41.1%和50.6%,差异均有统计学意义(P＜0.05)。 5.CS2染毒大鼠电镜观察结果：染毒大鼠脊髓组织神经元出现了溶酶体增多,暗神经元和脱颗粒现象；坐骨神经组织神经纤维出现轴突与髓鞘轻度分离,轴突内较多髓样小体,髓鞘板层分离和轴突闭锁现象。这些超微结构的改变,提示CS2染毒引起了脊髓运动神经元的损伤。 6.CS2染毒对大鼠自噬相关蛋白的影响：在脊髓组织中,与对照组相比,染毒动物脊髓中LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg1L显著升高,而p62显著降低。在坐骨神经中,与对照组相比,染毒组LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ、AtglL、Atg5、Atg12均显著降低,差异有统计学意义(p＜0.05)；600mg/kg染毒组Atg1H明显降低,降低了36.0%；600mg/kgCS2组p62和Ambra1显著上升,分别升高了23.7%、36.2%；400mg/kg、600mg/kg染毒组Beclinl明显降低,分别降低20.3%、24.1%。 7.CS2染毒对大鼠Akt-mTOR-p70S6K信号通路的影响：脊髓组织中,与对照组相比,各染毒组p-Akt, p-mTOR显著升高,差异具有统计学意义(P＜0.05)。Ak、mTOR、p70S6K、p-p70S6K无明显变化。坐骨神经中,与对照组相比,600mg/kgCS2染毒组p70S6K明显降低,降低了27.1%；400mg/kg和600mg/kgCS2染毒组p-p70S6K明显降低,分别降低了27.5%、25.5%,差异均有统计学意义(P＜0.05)。而Akt、p-Akt无明显变化。结论： 1.CS2灌胃染毒能成功建立中毒性周围神经病动物模型。 2.CS2可引起中毒动物血清肌酸激酶活性发生改变。 3.CS2可引起中毒动物脊髓和坐骨神经组织中自噬相关蛋白发生改变。 4.自噬干扰可能与CS2中毒性周围神经病的发生有关。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R114

【参考文献】