利用Caco-2细胞研究三种常用乳制品益生菌对肠道屏障功能影响
发布时间：2019-08-06 09:29
【摘要】：益生菌具有多种生理功能，被广泛应用于食品及医药领域，新型菌种的出现也加快了益生菌产业化的进程，同时益生菌的安全性问题引起了广大学者关注，大多数的益生菌在长期的使用过程中被认为是相对安全的，但是近年来许多菌属从人的感染性损伤组织中分离出来，并且也出现服用益生菌制品所导致的病例，这使得益生菌的安全性成为一个不容忽视的问题，引起了人们对益生菌安全性的重新认识。 目的：保加利亚杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌是乳制品中常用的三种益生菌，本文采用体外Caco-2细胞模型方法考察这三种常用乳制品益生菌对肠道屏障功能的影响，探讨这三种菌是否存在潜在的安全性问题。 方法：保加利亚杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌的活化培养，调整益生菌的浓度为102-108cfu/mL，分别与Caco-2细胞共培养，用MTT比色法考察这三种菌对Caco-2细胞的毒性作用，计算本实验条件下三种益生菌的IC50，将同一浓度三种益生菌按照1:1:1比例混合并计算混合菌的IC50；益生菌以108cfu/mL的浓度与分化的Caco-2细胞共培养48h，，ELISA方法检测细胞因子IL-1β、IL-10、TNF-α和IFN-γ的分泌；建立Caco-2单层细胞模型，益生菌以108cfu/mL的浓度与单层模型共培养24h，酶标仪检测酚红的透过率，透射电镜观察细胞模型的紧密连接结构；益生菌以108cfu/mL的浓度与Caco-2细胞共培养24h，通过免疫荧光法标记Caco-2细胞的β-微管蛋白，在激光共聚焦显微镜下观察；益生菌以108cfu/mL的浓度与Caco-2细胞共培养24h，western blot分析Caco-2细胞紧密连接蛋白Occludin的表达。 结果：保加利亚杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和混合菌在较低浓度时（≤104cfu/mL）对Caco-2细胞的增殖无显著影响，未表现出细胞毒性作用，当这三种益生菌的浓度≥105cfu/mL时，可显著的抑制Caco-2细胞（结肠癌细胞）增殖，当浓度≥107cfu/mL时，三种益生菌对Caco-2细胞表现出了细胞毒性作用，并计算得出了三种益生菌在本实验条件下的的半数抑制浓度（IC50），保加利亚杆菌IC50=1.19108cfu/mL、嗜酸乳杆菌IC50=3.93108cfu/mL、嗜热链球菌IC50=2.02108cfu/mL，混合菌IC50=3.93108cfu/mL益生菌对体外培养的Caco-2细胞无联合毒性作用；保加利亚杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌（108cfu/mL）作用于Caco-2细胞48h后，细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ及IL-10分泌无影响；保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌（108cfu/mL）作用于Caco-2细胞单层模型24h、48h、72h后，对Caco-2细胞单层模型酚红透过率无影响，嗜热链球菌（108cfu/mL）作用于72h后，显著增加了Caco-2细胞单层酚红透过率，三种益生菌作用24h后，在透射电镜下观察紧密连接结构完好，未出现异常变化，保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌单独作用未对细胞单层的紧密连接结构产生破坏性的影响；保加利亚杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌（108cfu/mL）与Caco-2细胞共培养24h，对细胞骨架蛋白β-tublin无影响；保加利亚杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌（108cfu/mL）与Caco-2细胞共培养24h，Caco-2细胞的紧密连接蛋白Occludin表达无影响。结论：体外Caco-2细胞试验表明，三种常用的乳制品益生菌并未对肠道屏障功能产生不良影响，不存在潜在的安全性问题。
【图文】：
2.1.2.3.2 三种益生菌联合作用将处于同一浓度级别的三种益生菌按照 1:1:1 的比例进行混合，各组菌浓度分别为 102、103、104、105、106、107、108cfu/mL，用 MTT 法检测细胞活性，具体操作方法同上。2.1.2.4 统计学方法实验数据采用 SPSS13.0 分析，方差分析采用 LSD 法（方差齐性）和 Dunnett’s法（方差非齐性），检验水准 α=0.05。2.2 结 果2.2.1 显微镜下观察 Caco-2 细胞的形态Caco-2 细胞经复苏培养后，状态良好，下图（图 2.1）为所培养细胞情况。每隔 1-3 天换液一次。当细胞达到 70 %-80 ％融合时，进行细胞传代。消化后的细胞呈圆形，且分散均匀。
嗜热链球菌（1000×） 嗜热链球菌（1000×）图 2.3 显微镜下观察经革兰氏染色后的益生菌Fig.2.3 Morphologic observation of probiotics stained by Gram's method2.2.4 益生菌的生长曲线2.2.4.1 保加利亚乳杆菌生长曲线保加利亚乳杆菌生长状况良好，随着时间的增加，OD 值逐渐增大，细菌的数量增多，在 4-12 小时之间，细菌数迅速增大，20 小时后细菌的数量趋于稳定。见图 2.4
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R151
本文编号：2523470
【图文】：
2.1.2.3.2 三种益生菌联合作用将处于同一浓度级别的三种益生菌按照 1:1:1 的比例进行混合，各组菌浓度分别为 102、103、104、105、106、107、108cfu/mL，用 MTT 法检测细胞活性，具体操作方法同上。2.1.2.4 统计学方法实验数据采用 SPSS13.0 分析，方差分析采用 LSD 法（方差齐性）和 Dunnett’s法（方差非齐性），检验水准 α=0.05。2.2 结 果2.2.1 显微镜下观察 Caco-2 细胞的形态Caco-2 细胞经复苏培养后，状态良好，下图（图 2.1）为所培养细胞情况。每隔 1-3 天换液一次。当细胞达到 70 %-80 ％融合时，进行细胞传代。消化后的细胞呈圆形，且分散均匀。
嗜热链球菌（1000×） 嗜热链球菌（1000×）图 2.3 显微镜下观察经革兰氏染色后的益生菌Fig.2.3 Morphologic observation of probiotics stained by Gram's method2.2.4 益生菌的生长曲线2.2.4.1 保加利亚乳杆菌生长曲线保加利亚乳杆菌生长状况良好，随着时间的增加，OD 值逐渐增大，细菌的数量增多，在 4-12 小时之间，细菌数迅速增大，20 小时后细菌的数量趋于稳定。见图 2.4
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R151
【引证文献】
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1 雷虹;王丽丽;孙梦媛;付斌;平文祥;;Lb.paracasei HD1.7对小鼠免疫能力的调节作用[J];黑龙江大学自然科学学报;2013年02期
本文编号：2523470
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