食品中谷物致敏原的常规PCR检测方法研究

发布时间：2021-06-16 18:34

　　本研究建立了四个常规PCR体系来检测食品中的谷物致敏原,它们分别是小麦特异性PCR体系Wheat217bp,燕麦特异性PCR体系Oatl71bp,大麦和黑麦的共同PCR体系BR108bp以及小麦、大麦和黑麦的共同PCR体系WBR155bp。通过使用不同裂解液处理样品以及对提取结果的比较,为谷物样品确定了最佳DNA提取方法。针对小麦的致敏蛋白一ω-醇溶谷蛋白和燕麦的致敏蛋白—燕麦蛋白,利用专业引物设计软件Primer3.0分别为它们设计特异性强的引物。运用软件ClustalW对小麦、大麦和黑麦的相关致敏蛋白编码序列进行同源性分析,并确定同源区域,然后针对同源区域运用专业引物设计软件Primer Premier5.0设计共同引物。在寻找黑麦和大麦各自特异性引物的过程中,找到了大麦和黑麦的一个共同引物,并发现了黑麦的一段新序列,此序列目前还没在有关核酸数据库中公布。PCR扩增结果经琼脂糖凝胶电泳以及凝胶成像系统分析后,并经测序进一步确证。结果表明各PCR体系具有较强特异性,理论检出限和实际检出限都至少分别可达1.0ng/μL和1.0%,扩增产物与目标序列具有很高匹配度,而且能检测热加工食品中... 

【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：90 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
    1.1 食物致敏
        1.1.1 食物致敏原的种类和危害
        1.1.2 致敏蛋白种类
        1.1.3 食物致敏原检测的必要性和重要性
    1.2 食物致敏原的检测方法
        1.2.1 基于蛋白质的检测方法
        1.2.2 生物学方法的不足之处
        1.2.3 基于DNA的检测方法
        1.2.4 食物中致敏原的新兴检测技术
    1.3 食物致敏原的相关法律法规
        1.3.1 国外已颁布的相关标准
        1.3.2 我国已颁布的相关标准
    1.4 本课题的研究内容及意义
        1.4.1 选定谷物致敏原为研究对象的背景及意义
        1.4.2 采用PCR法检测食物中谷物致敏原的意义及优越性
第2章 样品前处理和引物筛选
    2.1 引言
    2.2 材料与设备
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 实验设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 谷物样品的前处理方法
        2.3.2 采用植物通用引物tRNALeu验证样品DNA的扩增性
        2.3.3 目标序列查询
        2.3.4 引物的设计方案
        2.3.5 订购引物的处理方法
        2.3.6 引物特异性实验条件的摸索及优化
        2.3.7 琼脂糖凝胶电泳条件的选择及优化
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 DNA提取方法的选择
        2.4.2 样品DNA扩增性的验证试验结果
        2.4.3 目标序列的选择及论证确定
        2.4.4 引物特异性实验的结果与讨论
        2.4.5 琼脂糖凝胶电泳条件的优化结果
    2.5 本章小结
第3章 共同引物检测食品中谷物致敏原
    3.1 引言
    3.2 材料与设备
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验设备
    3.3 实验方法
        3.3.1 目标序列查询
        3.3.2 引物的设计方案
        3.3.3 引物特异性实验条件的摸索及优化
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 目标序列的选择及论证确定
        3.4.2 共同引物特异性实验结果讨论
    3.5 本章小结
第4章 实验结果确证和实样检测
    4.1 引言
    4.2 材料与设备
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验设备
    4.3 实验方法
        4.3.1 PCR产物的测序
        4.3.2 各PCR体系的检出限实验
        4.3.3 实样检测实验
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 测序结果比对及讨论
        4.4.2 各PCR体系的检出限讨论
        4.4.3 实样检测结果及讨论
    4.5 本章小结
第5章 ELISA方法验证WBR-PCR体系的可靠性
    5.1 引言
    5.2 材料与设备
        5.2.1 实验材料
        5.2.2 仪器与设备
    5.3 实验方法
        5.3.1 样品的前处理
        5.3.2 ELISA测定程序
        5.3.3 样品稀释条件的研究
        5.3.4 阳性质控确证试验和回收率试验
        5.3.5 精密度试验
        5.3.6 ELISA与WBR-PCR体系的检测结果比较
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 ELISA方法的工作曲线
        5.4.2 检出限和线性范围
        5.4.3 样品稀释条件的摸索结果
        5.4.4 质控确证和回收率实验结果
        5.4.5 精密度实验结果
        5.4.6 ELISA与PCR两种方法检测结果的比较
第6章 总结与展望
    6.1 本研究的成果总结
    6.2 实验评价
    6.3 可进一步改进和优化的部分
    6.4 致敏原检测的发展方向展望
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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[3]花生致敏蛋白Ara h1、2、3的研究进展[J]. 蒋圣娟,周正义,孙玉军,王松华.  生物医学工程学杂志. 2010(06)
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[7]食品中鱼源性成分PCR的检测方法[J]. 张舒亚,金丽琴,蒋剑琼,李妮,张佳谊,张晓峰.  食品与发酵工业. 2010(01)
[8]琼脂糖凝胶电泳实验技术研究[J]. 黄永莲.  湛江师范学院学报. 2009(06)
[9]婴幼儿牛奶蛋白过敏症的诊断和治疗指南[J]. 陈同辛,张慧.  实用儿科临床杂志. 2009(21)
[10]杏仁产品杏仁成分的PCR检测方法研究[J]. 覃芳芳,邓鸿铃,罗海英,郭新东,朱思明,吴玉銮.  现代食品科技. 2008(06)



本文编号：3233575