PM 2.5 致HBE细胞DNA损伤和致突变的分子机制研究

发布时间：2024-01-05 12:08

　　目的PM2.5经呼吸道可直接进入支气管和肺泡深处并在肺泡中沉积。当达到一定量后,能够引起上呼吸道细胞和肺泡细胞发生炎症反应和氧化应激反应,能够通过调控基因的表达来调控蛋白质的合成,从而诱导细胞的凋亡和DNA损伤。本研究旨在探讨PM2.5对人支气管上皮细胞(Human bronchial epithelial cells,简称HBE细胞)细胞凋亡、DNA损伤和致突变的分子机制,展开一系列研究,为进一步研究PM2.5对人体毒性提供科学依据,对探讨大气细颗粒物PM2.5致癌致突变的毒理学作用机制具有重要意义。方法1、用低剂量10μg/mL和高剂量50μg/mL的PM2.5水溶液对HBE细胞染毒,用未染毒的细胞作为空白照组,同时设立10μM的Cr⁶⁺染毒的HBE细胞为阳性对照组,应用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2的mRNA表达水平变化,Western blot检测凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2的蛋白质表达水平变化。2、用p38...

【文章页数】：95 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 PM2.5 的危害
    1.2 PM2.5 对HBE细胞的毒性作用的研究现状
    1.3 本课题的研究目的、意义与技术路线
    研究目的
    研究意义
    技术路线
第2章 PM2.5 对HBE细胞凋亡基因表达水平的影响
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 细胞来源
        2.2.2 PM2.5 样品来源
        2.2.3 主要试剂与耗材
        2.2.4 主要仪器
        2.2.5 常用试剂的配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 PM2.5 样品的处理
        2.3.2 细胞的培养与处理
        2.3.3 引物的设计与合成
        2.3.4 引物扩增效率与特异性
        2.3.5 HBE细胞总RNA的提取
        2.3.6 Q-PCR检测凋亡基因的m RNA表达水平
        2.3.7 HBE细胞蛋白的提取
        2.3.8 HBE细胞蛋白的BCA定量
        2.3.9 Western blot检测蛋白表达水平
        2.3.10 统计分析
    2.4 实验结果
        2.4.1 引物验证
        2.4.2 凋亡基因表达水平变化
        2.4.3 目的蛋白表达水平变化
    2.5 讨论
第3章 MAPK/PKC信号通路对PM2.5 致凋亡基因表达的影响
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 细胞来源
        3.2.2 PM2.5 样品来源
        3.2.3 主要试剂与耗材
        3.2.4 主要仪器
        3.2.5 常用试剂的配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 PM2.5 样品的处理
        3.3.2 细胞的培养与处理
        3.3.3 引物的设计与合成
        3.3.4 引物扩增效率与特异性
        3.3.5 HBE细胞总RNA的提取
        3.3.6 Q-PCR检测凋亡基因的m RNA表达水平
        3.3.7 HBE细胞蛋白的提取
        3.3.8 HBE细胞蛋白的BCA定量
        3.3.9 Western blot检测 3β-HSD蛋白表达水平
        3.3.10 统计分析
    3.4 实验结果
        3.4.1 p38 MAPK对凋亡基因m RNA和蛋白表达水平的影响
        3.4.2 ERK和PKC对凋亡基因的相对表达水平的影响
    3.5 讨论
第4章 PM2.5 对HBE细胞DNA损伤作用探讨
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 细胞来源
        4.2.2 PM2.5 样品来源
        4.2.3 主要试剂与耗材
        4.2.4 主要仪器
        4.2.5 常用试剂的配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 PM2.5 样品的处理
        4.3.2 细胞的培养与处理
        4.3.3 引物的设计与合成
        4.3.4 引物扩增效率与特异性
        4.3.5 HBE细胞总RNA的提取
        4.3.6 Q-PCR检测DNA损伤修复基因h OGG1和h MTH1的m RNA表达水平
        4.3.7 HBE细胞蛋白的提取
        4.3.8 HBE细胞蛋白的BCA定量
        4.3.9 Western blot检测 3β-HSD蛋白表达水平
        4.3.10 单细胞凝胶电泳(彗星)实验检测DNA损伤情况
        4.3.11 统计分析
    4.4 实验结果
        4.4.1 引物验证
        4.4.2 DNA损伤修复基因表达水平变化
        4.4.3 目的蛋白表达水平变化
        4.4.4 细胞DNA损伤情况
    4.5 讨论
第5章 PM2.5 样品致突变作用研究
    5.1 引言
    5.2 实验材料
        5.2.1 PM2.5 样品来源
        5.2.2 主要试剂与耗材
        5.2.3 主要仪器
        5.2.4 常用试剂的配制
    5.3 实验方法
        5.3.1 PM2.5 样品的处理
        5.3.2 鉴定菌株
        5.3.3 Ames实验
        5.3.4 统计分析
    5.4 实验结果
        5.4.1 菌株鉴定结果
        5.4.2 Ames实验结果
    5.5 讨论
第6章 PM2.5 染毒HBE细胞的基因芯片检测分析
    6.1 引言
    6.2 实验材料
        6.2.1 PM2.5 样品来源
        6.2.2 主要试剂与耗材
        6.2.3 主要仪器
        6.2.4 常用试剂的配制
        6.2.5 基因芯片
    6.3 实验方法
        6.3.1 PM2.5 样品的处理
        6.3.2 细胞的培养与处理
        6.3.3 样本RNA提取和纯化
        6.3.4 样本制备质控
        6.3.5 芯片杂交与扫描
        6.3.6 生物信息分析
        6.3.7 引物的设计与合成
        6.3.8 Q-PCR验证核心基因的m RNA表达水平
    6.4 实验结果
        6.4.1 基因的差异表达与聚类分析
        6.4.2 差异表达基因的GO功能注释富集分析
        6.4.3 差异表达基因的通路富集分析
        6.4.4 差异表达基因的蛋白交互作用分析
        6.4.5 引物验证
        6.4.6 Q-PCR验证h PHACTR2、h SFRP1、h WFDC1基因表达水平
    6.5 讨论
第7章 结论
参考文献
综述
    参考文献
攻读硕士学位期间取得的成果
致谢



本文编号：3877037