翼齿六棱菊5β-olide分离纯化及生物学活性评价

发布时间：2020-03-28 04:25

【摘要】：天然抗肿瘤药物是抗癌药物的一个重要分支,在临床抗癌治疗中占有极其重要的地位。本研究选择具有清热消炎止咳作用,以及抗肿瘤潜力的中药——翼齿六棱菊为研究对象,分离纯化所含的小分子化合物,从中筛选具有促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长活性的物质,并探讨其体外抗肿瘤作用的活性,为寻找高效、靶标独特的抗肿瘤新药提供研究基础。取得了以下结果。1、应用硅胶、凝胶、高效液相等多种色谱分离技术,从翼齿六棱菊中分离到7个候选化合物,包括4个黄酮和3个倍半萜;经NMR,MS等方法检测,分别鉴定为5β-olide、Isocostic acid、3H-Naphth[1,8a-b]oxirene-7-acetic acid、Artemetin、3,6,7,4'-Tetra-O-methyl-5,3'-dihydroxyflavone、5-hydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3,6,7-trimethoxy-4H-chromen-4-one、4',5-Dihydroxyflavone。2、采用MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)法评价翼齿六棱菊中分离到的上述7个化合物的体外抗肿瘤活性,浓度40μM时抑制率分别为90%、11.3%、4%、9.7%、16.1%、0%、2.9%,结果表明5β-olide抑癌活性最好。3、采用MTT法将5β-olide对SMMC 7721、SW480、MDA-MB-231、T47D和Hela这5株肿瘤细胞进行IC_(50)测定,其IC_(50)分别为3.36mM/L、4.04mM/L、11.8mM/L、10.57mM/L、14.31mM/L。4、通过检测5β-olide处理后SMMC 7721、SW480的生长曲线,发现5β-olide浓度≥2mM,处理24h,开始出现细胞增殖的抑制活性。5、应用荧光显微镜观察SMMC 7721细胞核形态的变化;8mM的5β-olide处理SMMC 7721细胞24 h,细胞核发生了明显的畸形变化,一些细胞核呈月牙型且皱缩边集化,具有典型的凋亡形态。采用Hoechst/PI(Propidium Iodide)染色后发现,随着5β-olide浓度的加大和作用时间的延长,亮蓝色的细胞增多,表明细胞凋亡增加。6、应用DCFH-DA(2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate)方法检测5β-olide对SMMC7721内源活性氧的影响;通过ROS(reactive oxygen species)清除试验检测细胞凋亡是否与ROS有关;结果表明,H_2O_2组及8mM 5β-olide处理组诱导明亮的绿色荧光产生,说明此时ROS大量生成;当加入NAC(N-acetyl-L-cysteine)清除ROS之后,5β-olide对SMMC 7721的细胞毒性显著降低,说明5β-olide是通过触发ROS过度产生引起SMMC7721凋亡。7、通过检测JC-1(5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl imidacarbocyanine iodide),观察5β-olide对SMMC 7721线粒体膜电位的影响;使用Mito-tracker Red探针标记细胞线粒体后,在激光共聚焦下观察5β-olide对细胞线粒体形态的影响;研究发现:Control组细胞红色荧光较强,FCCP组绿光较强,随着5β-olide的浓度增加,绿色荧光逐渐增强,8mM时绿色荧光较强;用Mito-tracker Red染料染色,可发现5β-olide处理后的细胞线粒体呈颗粒状,说明5β-olide能降低线粒体膜电位,使线粒体破碎。8、Western blot方法,观察5β-olide处理SMMC 7721前后细胞线粒体凋亡通路相关蛋白的变化;发现5β-olide处理组Bax、Bid上调,Bcl-2下调,caspase 3和PARP上调。9、采用克隆形成试验、细胞划痕及transwell试验,检测5β-olide对SMMC 7721细胞生理性能的影响。5β-olide处理细胞24 h后,随着5β-olide浓度升高,单克隆形成的集落越少;细胞划痕愈合减少,愈合能力逐渐减弱,transwell细胞迁移到下室的数量也减少。结论:从翼齿六棱菊中分离到7个化合物,其中5β-olide抗肿瘤活性最好,并且可以抑制多种肿瘤细胞的增殖,对SMMC 7721抑制最强。5β-olide能引起7721细胞凋亡并使ROS过度产生,使线粒体膜电位降低,线粒体促凋亡蛋白Bax、Bid上调,抑凋亡蛋白Bcl-2下调,最终导致激活caspases启动细胞凋亡的级联反应。因此本研究首次揭示了化合物5β-olide可以通过线粒体caspases途径引起7721细胞凋亡且也是ROS依赖的凋亡。5β-olide能抑制细胞克隆的形成,细胞迁移。本研究为开发新型抗肿瘤药物提供了基础研究。
【图文】：

图片,疗效,臭灵丹,全草

棱菊化学成分及生物活性研究六棱菊概述六棱菊属植物共 3 种，其中作为药用并被《中药大辞典》收载的齿六棱菊。这两种六棱菊属植物均以干燥全草入药，具有悠久的用（Laggerapterodonta(DC.)Benth.）是菊科、六棱菊属草本。主要在云南民间称臭灵丹，人们常常直接采集回来煮沸后过滤，喝滤而后有回甜，据记载具有止咳，清热消炎的作用。经过科研人员的验证，证明翼齿六棱菊确实有疗效，应用广泛。近年来开发出多且收到了较好的疗效,主要有翼齿六棱菊注射液、翼齿六棱菊口服和翼齿六棱菊片剂、翼齿六棱菊浸膏等[2]。

黄酮,黄酮类化合物,二羟基,甲氧基

贵州大学硕士研究生学位论文1.2.1 黄酮类化合物作为菊科植物,翼齿六棱菊中同样含有大量的黄酮类化合物,昆明植物研究所郝小江课题组李顺林等[3]，从翼齿六棱菊中分离鉴定了 penduletin（4’-5-二羟基-3，6，7-三甲氧基-黄酮）、5-hydroxy-3，4’，6，7-tetramethoxynavone、chrysosplenetin（4’-5-二羟基-3，3’，6，7-四甲氧基-黄酮）、artemitin（5-羟基-3，3’，4’，，6，7-五甲氧基-黄酮）。曹长姝等[4]人鉴定了几种黄酮类化合物，主要有金腰乙素、槲皮素等，并从中测定了这类化合物对肿瘤细胞生长的抑制作用。部分代表结构如下
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284.2;R285

【参考文献】