吴茱萸碱衍生物及其纳米制剂对H1688小细胞肺癌细胞株抗肿瘤作用研究
发布时间：2020-03-28 12:37
【摘要】：【目的】研究吴茱萸碱的两种不同衍生物:吴茱萸碱硝基化合物(Evodiamine nitro compound,END)和吴茱萸碱氨基衍生物(Evodiamine amino derivative,EAD)以及它们的纳米制剂吴茱萸碱硝基衍生物磷脂复合物(Evodiamine nitro derivative complex,ENPD)和吴茱萸碱氨基衍生物磷脂复合物(Evodiamine amino derivative complex,EAPD)对小细胞肺癌H1688细胞株的抗肿瘤活性及作用机制。【方法】体外培养H1688小细胞肺癌细胞株,在不同浓度EVO、END、EAD、ENPD、EAPD作用后和相同浓度不同作用时间作用后,运用MTT法检测细胞存活率、用流式细胞术考察H1688细胞凋亡的情况和有丝分裂周期。荧光探针染色考察H1688细胞内活性氧、钙离子浓度和线粒体膜电位变化。并用细胞器共定位等方法观察荧光标记的纳米磷脂复合物在细胞中被摄取的行为和主要摄取部位。另用western blot检测caspase 12、caspase 9、caspase 3、cyt C等凋亡相关蛋白及chop、bim等内质网应激相关蛋白和自噬标志蛋白LC 3的表达。继而采用裸鼠体内成瘤、HE染色等方法进一步考察吴茱萸碱衍生物及其纳米磷脂复合物对小细胞肺癌细胞株H1688细胞的体内抗肿瘤作用。【结果】MTT结果显示,END与EAD及其纳米制剂ENPD与EAPD都对H1688小细胞肺癌细胞有抑制作用,且呈时间和浓度依赖性,以END及ENPD作用最强。流式细胞术检测发现,END、EAD、ENPD、EAPD均可诱导H1688细胞发生凋亡,且阻滞其有丝分裂于G2/M期。用以上方法考察END、EAD、ENPD、EAPD对H1688细胞的效应后,进一步检测凋亡相关指标发现经以上药物处理后H1688细胞内线粒体膜电位下降,活性氧升高及钙离子浓度升高,显示出明显的凋亡现象。Western blot结果显示,END、EAD处理后,H1688细胞的caspase 3/9/12等蛋白表达上调不明显,但ENPD和EAPD作用后caspase 3/9/12明显上调,且Cyt C释放增加,同时自噬蛋白LC 3Ⅰ/LC3Ⅱ值在EVO、END、EAD、ENPD、EAPD处理后显著降低。以上结果说明END、EAD、ENPD、EAPD均能通过线粒体途径诱导H1688细胞发生凋亡但END与EAD效果远弱于ENPD和EAPD,同时可诱导自噬发生。对纳米磷脂复合物在细胞中的行为进行考察后可知,ENPD和EAPD主要通过细胞内质网摄取,并聚集于胞质中,使ENPD和EAPD更多聚集于内质网附近诱导内质网应激发生。裸鼠体内成瘤实验显示各化合物均能抑制裸鼠体重下降和体内肿瘤生长。【结论】两种不同的吴茱萸碱衍生物END和EAD都具有抗小细胞肺癌细胞H1688的抗肿瘤活性,且抗肿瘤活性比母体药物EVO更显著,END作用最强。纳米磷脂复合物ENPD和EAPD增强了药物抗肿瘤作用。各化合物的主要抗肿瘤机制均是通过线粒体途径诱导H1688细胞发生凋亡,也与药物诱导自噬增强有关。
【图文】：
剂的方法改善其生物利用度使吴茱萸碱的抗肿瘤应用前景得到显著改来，国内外对吴茱萸碱进行了不同衍生物的合成与筛选并成为改良吴瘤活性的研究热点，目前多数研究的衍生物有：烷基，苯甲酰基，苄到吴茱萸碱的吲哚氮原子中[14]；有活性的 10-羟基吴茱萸碱和 3-氨基-1萸碱[15]等。那么，吴茱萸碱经过衍生后，其衍生物抗肿瘤的活性和机，其药学特征和构效关系均值得进一步研究，也是为发掘新药提供重据。故本课题主要研究 EVO 的两种不同的衍生物，吴茱萸碱氨基衍生物和基衍生物（结构式如图 1 所示）对 H1688 细胞株的抗肿瘤活性以及机药物-纳米磷脂复合物[16]的方法进一步提高 END 与 EAD 对细胞的亲和利用度。同时对 END、EAD 以及它们的纳米制剂在体内的抗肿瘤活性进行初步评价。
分别考察了 END、EAD 在不同浓度（0 μM、0.625 μM、1.25μM、2.5 μM5 μM、10 μM 和 20 μM）和不同时间（24 h、48 h、72 h）对 H1688 细胞存活率的影响。用 0.625μM 的 EVO、END、EAD 处理 24 h，H1688 细胞即可观察到细胞死亡。高浓度 END 和 EAD（20 μM）处理 24 h、48 h、72 h 后，其存活率分别为约16.45 %和 61.20 %（24 h）、9.10 %和 43.37 %（48 h）、5.24 %和 29.55 %（72 h），与 0 μM 相比显著降低。EVO 处理组存活率分别为 60.81 %（24 h）、21.99 %（4h）、18.51 %（72 h）。24 h 时 EVO 和 EAD 仅最高浓度（20 μM）的存活率与 Contro组存在显著性差异，10 μM 组与 Control 组存活率之间未见显著性差异（EVO 组P= 0.438> 0.05；EAD 组 P= 1.000> 0.05）而 END 组在处理 24 h 后存活率与 Contro组存活率间即出现明显差异（P= 0.010< 0.05）。END、EAD 对 H1688 的抑制作用呈现时间依赖性和剂量依赖性，，20 μM END处理 72 h后对H1688的抑制效果最好存活率仅 5.24 %，如图 1 所示。A EVO B END C EAD
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
本文编号：2604457
【图文】：
剂的方法改善其生物利用度使吴茱萸碱的抗肿瘤应用前景得到显著改来，国内外对吴茱萸碱进行了不同衍生物的合成与筛选并成为改良吴瘤活性的研究热点，目前多数研究的衍生物有：烷基，苯甲酰基，苄到吴茱萸碱的吲哚氮原子中[14]；有活性的 10-羟基吴茱萸碱和 3-氨基-1萸碱[15]等。那么，吴茱萸碱经过衍生后，其衍生物抗肿瘤的活性和机，其药学特征和构效关系均值得进一步研究，也是为发掘新药提供重据。故本课题主要研究 EVO 的两种不同的衍生物，吴茱萸碱氨基衍生物和基衍生物（结构式如图 1 所示）对 H1688 细胞株的抗肿瘤活性以及机药物-纳米磷脂复合物[16]的方法进一步提高 END 与 EAD 对细胞的亲和利用度。同时对 END、EAD 以及它们的纳米制剂在体内的抗肿瘤活性进行初步评价。
分别考察了 END、EAD 在不同浓度（0 μM、0.625 μM、1.25μM、2.5 μM5 μM、10 μM 和 20 μM）和不同时间（24 h、48 h、72 h）对 H1688 细胞存活率的影响。用 0.625μM 的 EVO、END、EAD 处理 24 h，H1688 细胞即可观察到细胞死亡。高浓度 END 和 EAD（20 μM）处理 24 h、48 h、72 h 后，其存活率分别为约16.45 %和 61.20 %（24 h）、9.10 %和 43.37 %（48 h）、5.24 %和 29.55 %（72 h），与 0 μM 相比显著降低。EVO 处理组存活率分别为 60.81 %（24 h）、21.99 %（4h）、18.51 %（72 h）。24 h 时 EVO 和 EAD 仅最高浓度（20 μM）的存活率与 Contro组存在显著性差异，10 μM 组与 Control 组存活率之间未见显著性差异（EVO 组P= 0.438> 0.05；EAD 组 P= 1.000> 0.05）而 END 组在处理 24 h 后存活率与 Contro组存活率间即出现明显差异（P= 0.010< 0.05）。END、EAD 对 H1688 的抑制作用呈现时间依赖性和剂量依赖性，，20 μM END处理 72 h后对H1688的抑制效果最好存活率仅 5.24 %，如图 1 所示。A EVO B END C EAD
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 冯长梅;王占黎;周立社;;吴茱萸碱作为多靶点化合物的药理学研究进展[J];医学综述;2015年04期
2 张志仙;蒋美玲;王欣慧;李云展;龚国清;;吴茱萸碱的药理学研究进展[J];现代生物医学进展;2014年21期
3 姚迪;孙晶晶;刘雷;顾桂英;马博;张琪;佘金雄;;LC-MS/MS法测定大鼠血浆中的吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸内酯及其生物利用度的研究[J];华西药学杂志;2014年03期
本文编号：2604457
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