药桑椹总黄酮的抗炎镇痛活性研究

发布时间：2020-04-01 12:15

【摘要】：药桑是生长于我国新疆的一种黑桑,是具有最高染色体倍性的桑树资源。药桑椹含有丰富的花青素、黄酮等成分,是维族治疗扁桃腺炎、咽喉肿痛等疾病的传统维药,具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗肿瘤等活性。炎症是机体因机械损伤、细菌或病毒感染、有毒药物等损害因子引起,多细胞、多因子参与的复杂免疫防御过程。其基本症状包括红、热、肿、痛,是人类疾病中一种最常见的基本病理过程。炎症一般可分为急性和慢性炎症,一方面,急性炎症是机体的一种防御保护机制,可有效阻止感染和损伤的恶性发展;另一方面,炎症反应过度或慢性长期性炎症的持续会对机体造成或重或轻的损害。如咽喉炎所致的疼痛,药物过敏危及生命,胆固醇增加和血栓形成,风湿性关节炎疼痛等。目前市场上使用的甾体及非甾体类抗炎镇痛药物都有一定的毒副作用,每年因此受到影响的炎症药物使用者超过百万计。因此,研制天然无毒副作用的抗炎药物,对慢性或持续性炎症进行控制具有重要意义。本研究首先使用正交试验设计和响应面试验设计,优化得到了药桑椹总黄酮(MnTF)的最佳提取工艺。同时,我们开发了新的超高效液相连用紫外和质谱(UPLC-TUV/QDa)方法,对主要黄酮类成分进行鉴定分析,并检测分析了26个种质资源桑椹的总黄酮(TF)、花青素、黄酮醇的含量和分布情况,分析了不同成熟度药桑的花青素和黄酮醇含量的变化趋势,根据成分分布和果色对桑椹进行分型。进而我们比较分析了黑桑与非黑桑在黄酮成分上的差异,通过毒性和抗炎镇痛评估、细胞因子检测、炎症相关蛋白表达量分析、抗氧化抗菌活性分析,对黑桑和非黑桑的抗炎镇痛活性进行比较研究,并探究其主要抗炎镇痛活性物质和抗炎作用通路。主要结果如下:1、MnTF提取工艺优化利用6因素2水平的正交试验,筛选得到决定MnTF提取率的3个主要因素分别为乙醇体积分数、提取温度和提取次数。通过单因素试验及3因素3水平的响应面试验设计获得MnTF的最佳提取条件:48%乙醇、温度80℃、重复提取4次。MnTF得率预测为2.32%,实测2.31%。进一步比较了不同提取方案对MnTF的提取率、抗氧化活性(包括还原力、羟自由基和超氧阴离子自由基清除力)、实际效率和效益后,确定MnTF的最优提取方案为:38%乙醇、60℃重复提取2次、15 min/次、料液比1∶10、超声功率500 W,MnTF得率为2.22%。2、26个资源桑椹的TF、花青素、黄酮醇测定分析通过新建立的UPLC-TUV/QDa方法可对桑椹中主要黄酮类化合物,包括3种花青素和5种黄酮醇快速定性定量分析。对26个桑椹资源的调查显示:药桑椹含有丰富的黄酮类化合物,并且TF(35.39 mg/g)、矢车菊素-3-O-葡糖苷(C3G,8.29 mg/g)、矢车菊素-3-O-芸香糖苷(C3R,2.89 mg/g)和槲皮素(Qu,74.44μg/g)含量是26个资源中最高的。通过对不同果色或成熟度的药桑椹成分分析发现,在桑椹红变黑的时期,花青素含量急速升高,大部分果色变黑后,花青素含量又逐渐下降,而整个桑椹发育成熟阶段,黄酮醇成分含量都较低,但芦丁在这一时期含量逐渐升高。不同果色桑椹的花青素和黄酮醇含量存在明显差异,经统计分析发现,桑椹颜色越深其花青素和黄酮醇含量越高。这些桑椹通过主成分分析(PCA)和颜色比较主要可分为3类:一是黑桑椹,花青素和黄酮醇含量丰富,颜色紫黑,代表为药桑、红果2号等;二是红或红黑混色桑椹,花青素和黄酮醇含量中等,代表为蒙桑、台湾长果桑等;三是白果桑椹,不含或少量含有花青素,黄酮醇含量较少,代表为珍珠白、白玉王等。3、黑桑(药桑)与非黑桑(蒙桑和珍珠白)抗炎、镇痛和抗菌活性的比较及其机理研究比较分析了黑桑总黄酮(MnTF)和非黑桑总黄酮(包括蒙古桑总黄酮MmTF和珍珠白总黄酮MazTF)的抗炎、镇痛和抗菌活性。MnTF花青素达11.43 mg/g,黄酮醇0.70 mg/g,相比之下,MmTF和MazTF的黄酮醇含量较低,MazTF则不含花青素。通过对小鼠体重的监测和RAW264.7细胞活力的测定试验表明,三种桑椹总黄酮(TFs)都没有毒副作用。通过福尔马林诱导小鼠脚趾疼痛试验、二甲苯诱导小鼠耳肿胀试验和角叉菜胶诱导小鼠脚趾水肿试验证明,MnTF相对于MmTF和MazTF具有更出色的镇痛和消肿活性,MnTF的镇痛消肿作用呈剂量依赖性增强。采用ELISA法检测小鼠血清中促炎细胞因子白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和一氧化氮(NO)水平表明,MnTF(50、100 mg/kg)可显著抑制或清除这些细胞因子。在蛋白水平上,MnTF可显著抑制炎症关键蛋白诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化物酶2(COX2)、磷酸化p65(p-p65)和磷酸化IκBα(p-IκBα)的表达,并增加抗炎因子白介素-10(IL-10)的表达。通过单体化合物的小鼠镇痛试验证明,C3G、芦丁(Ru)和异槲皮素(IQ)3种主要桑椹黄酮具有显著镇痛活性。同时,MnTF显示良好的还原力和自由基(OH~-,O_2~-,DPPH和ABTS)清除活性,这可能是其良好抗炎镇痛活性的基础。通过对致炎性细菌,包括大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗菌试验证明,MnTF的抗菌活性显著高于MmTF和MazTF,MnTF对上述三种疾病的最小杀菌浓度(MBC)分别为2、2、1.8 mg/mL。综上所述,本研究优化了MnTF的提取工艺,采用UPLC-TUV/QDa鉴定到桑椹中主要有3种花青素和5种黄酮醇。进一步检测分析了26个种质资源桑椹的总黄酮、花青素、黄酮醇的含量分布情况,根据成分分布和颜色差异确定桑椹主要类型可分为黑、红、白三色桑椹。进而比较分析了黑桑与非黑桑的抗炎镇痛活性。结果表明MnTF相对MmTF和MazTF具有更出色的镇痛、消肿和抗菌活性,这些特性与其所含丰富的花青素(C3G和C3R)和黄酮醇(Ru),以及其对炎症细胞因子、iNOS、COX2和核因子-κB(NF-κB)途径相关蛋白的抑制作用密切相关。
【图文】：

研究进展原酮，是一类拥有 C6-C3-C6 基央吡喃环（C 环）氧化水平和两型的黄酮化合物[9,10]，如黄酮、[11]。自然界中，黄酮类化合物主单糖、双糖、三糖和酰化糖）、位苷固体多是无定形粉末，其余则轭体系，，以电子转移和重排延长了黄酮苷常能与强极性溶剂水、乙醇有机溶剂，黄酮苷的糖苷链越长则不紧密，分子间引力降低而有利于有多个酚羟基，故呈酸性，酚羟基

图 3.1 标准品曲线Fig. 3.1 Standard curve各因素正交水平，设计 L8(27)正交试验，结果表 3.2 L8(27)正交试验设计及结果Table 3.2 Design and results of L8(27) orthogonal arB C D E F 1 1 2 2 1 1 2 2 1 1 2 2 2 2 2 2 1 2 1 2 1 2 1 1 2 1 1 1 2 2 2 1 1 1 1 2 2 1 2 1 % 7.77% 7.60% 7.37% 7.85% 7.40%
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

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本文编号：2610441