【摘要】：肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是一种由诸多原因引起的以肺泡结构严重破坏,弥散性肺泡炎症及肺间质纤维化为特点的疾病。随着工业化的不断发展,PF发病人数逐年增加,但是由于缺乏有效的治疗手段,患者的预后差,死亡率高,严重影响人类健康。现有的作用于单一靶点,单一细胞内信号转导通路的药物均不能有效地延长肺纤维化患者的生存时间和提高其生存质量。吡非尼酮、尼达尼布等是目前临床上治疗PF的常用药物,但其作用靶点单一,且存在不同程度的副作用而不宜长期使用。一些中草药及其有效成分在治疗肺纤维化中具有作用于多靶点、多通路及副作用小的特点,因此成为研究的热点。去氢木香烃内酯(dehydrocostus lactone,DCL)是由我国菊科植物云木香的干燥根中分离出来的萜类化合物。有研究表明,DCL具有抗炎、抗氧化等药理作用。我们在前期药物筛选中发现,DCL可减轻博莱霉素诱导的小鼠肺部的炎性损伤。本研究拟采用体内、外实验性PF模型,对DCL进行药效研究与机制探讨。目的:分别采用博莱霉素诱导的小鼠PF模型及TGF-β_1诱导的HELF细胞PF模型,研究DCL抗PF作用及其分子作用机制,为DCL用于临床治疗PF提供实验基础和理论依据。方法:1.DCL对BLM诱导小鼠PF模型作用昆明种健康雄性小鼠120只,随机分为6组:对照组(Control)、博莱霉素组(bleomycin,BLM)、DCL低(DCLL)、中(DCLM)、高(DCLH)剂量组及吡非尼酮组(pirfenidone,PFD),每组20只。除Control组小鼠气管内滴入0.9%氯化钠注射液外,其余各组动物均经气管内一次性滴入BLM溶液5 mg/kg,建立肺纤维化模型。第2天开始治疗组动物开始灌胃给药,每天一次,连续21天。DCLL、DCLM及DCLH组的剂量分别为5、10及20 mg·kg~(-1)·d~(-1),PFD组的剂量为50mg·kg~(-1)·d~(-1),Control及BLM组均给予等容量的生理盐水。在造模后第7、14及21天,记录小鼠的体重及存活率,随后处死动物,取血及留取肺组织样本,-80℃冻存备用。采用HE及Masson染色观测小鼠肺组织形态变化、炎症程度以及胶原累积程度;免疫组织化学法和Western Blot法检测小鼠肺组织中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和α-SMA表达;ELISA试剂盒检测肺组织中羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量。2.DCL对TGF-β_1诱导HELF细胞PF模型的作用正常培养的人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast,HELF)接种于6孔板中,调整细胞密度为1×10~5个/mL,每孔2 mL,培养24 h后弃上清。随机分为6组:对照组(Control)、TGF-β_1组(Model)、DCLL、DCLM、DCLH及PFD组。各组均用2 mL无血清DMEM,除对照组外,其他组均加入10μg/L TGF-β_1,再培养24 h后弃上清。随后,(1)Control组及(2)Model组加入2 mL无血清DMEM;(3)-(5)组,即DCLL、DCLM及DCLH组,分别加入2 mL含5、10或20μM DCL的无血清DMEM;(6)PFD组加入2 mL含10μM PFD的无血清DMEM。各组培养24 h后,于显微镜下观察细胞形态变化;MTT法检测细胞存活率;收集细胞全蛋白和核蛋白,Western Blot法检测细胞Collagen-Ⅲ、Collagen-Ⅰ和α-SMA表达;细胞免疫荧光法检测细胞内α-SMA表达。3.DCL对氧化应激水平的影响在TGF-β_1诱导HELF细胞PF模型及BLM诱导小鼠PF模型上,分别采用流式细胞术检测DCL对HELF细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的影响;ELISA试剂盒检测小鼠肺组织中GSH含量,小鼠血清中MDA及SOD含量。4.DCL对TGF-β_1/Smad_2和NOX_4/Nrf_2通路的影响Western Blot法检测TGF-β_1诱导HELF细胞PF模型及BLM诱导小鼠PF模型上TGF-β_1、Smad_2、p-Smad_2、NOX_4及Nrf_2表达,并检测细胞核蛋白中Nrf_2表达。5.预测潜在治疗因子的验证正常培养的HELF细胞,接种于6孔板中,调整密度为1×10~5个/mL,每孔2 mL。培养至细胞密度达70%-80%时更换新鲜无抗生素、无血清的DMEM,准备进行转染。观察Nrf_2 siRNA对细胞增殖率、纤维化程度及细胞内信号转导通路因子的影响,实验分为4组:Control、TGF-β_1组、TGF-β_1+阴性对照组及TGF-β_1+Nrf_2 siRNA组。观察Nrf_2基因敲低后DCL对细胞增殖率、纤维化程度及细胞内信号转导通路的影响,实验分为5组:Control、TGF-β_1组、DCL+TGF-β_1组、TGF-β_1+DCL+阴性对照组及TGF-β_1+DCL+Nrf_2 siRNA组。转染4-6 h后弃培养基,重新加入无抗生素、无血清DMEM继续培养48 h,荧光显微镜下观察绿色荧光判断转染率。除Control外,各组均加入10μg/L的TGF-β_1刺激24 h,成肺纤维化模型,再加入10μM的DCL,24h后收集细胞。Western Blot检测Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和α-SMA蛋白表达。结果:1.DCL减轻BLM诱导的小鼠肺纤维化给予BLM后,小鼠的一般状况较差,而不同剂量的DCL组小鼠的一般状况良好。HE染色结果显示,BLM组的肺组织结构破坏严重,损伤分布广泛。用药各组随着用药时间延长肺组织结构逐渐清晰、形态基本恢复正常,肺泡间隔增厚不明显。Szapiel评分结果显示,DCL各剂量组小鼠肺泡炎症程度均明显减轻(P0.05)。Masson染色结果表明,BLM组的肺组织出现大量胶原纤维,用药各组的纤维化程度明显减少(P0.05或P0.01)。与BLM组相比,用药各剂量组小鼠肺组织中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和α-SMA蛋白表达及HYP水平显著性降低(P0.01)。给药后21天,与DCLL组相比,DCLH组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ及α-SMA蛋白表达(P0.05或P0.01)明显减少;并且与PFD组相比,DCLH组上述三项指标也有显著降低(P0.05或P0.01);DCLH组HYP水平显著低于DCLL组(P0.05)。2.DCL减轻TGF-β_1诱导HELF细胞纤维化。MTT结果显示,浓度不高于20μM时,DCL未见明显的细胞毒性。与Model组比较,DCL各剂量组Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ均降低;细胞免疫荧光和Western Blot检测α-SMA,结果显示,正常组和用药各剂量组HELF细胞中α-SMA蛋白表达均显著降低(P0.05)。与DCLL组相比,DCLH组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ及α-SMA蛋白表达显著降低(P0.05或P0.01)。3.DCL对氧化应激水平的影响检测小鼠肺组织中GSH含量、血清中MDA、SOD含量及细胞内ROS水平。结果显示,与BLM组相比,DCLL、DCLM及DCLH组的MDA水平显著性降低(P0.05),SOD水平均显著性升高(P0.05),ROS水平显著降低(P0.05),DCLM和DCLH组GSH水平显著性升高(P0.05)。4.DCL对TGF-β_1/Smad_2和NOX_4/Nrf_2通路影响检测小鼠肺组织及细胞内TGF-β_1、Smad_2、NOX_4和Nrf_2蛋白表达水平。结果显示,与BLM组相比,DCL各剂量组小鼠肺组织中TGF-β_1、p-Smad_2、NOX_4蛋白表达显著性降低(P0.05),Nrf_2蛋白表达显著升高(P0.05);结果显示,与TGF-β_1模型组相比,DCL各剂量组HELF细胞中TGF-β_1、p-Smad_2、NOX_4蛋白显著降低(P0.05),Nrf_2在核蛋白和全蛋白中表达显著升高(P0.05),在胞浆中表达降低。5.预测治疗PF潜在因子的验证结果显示,与Control组相比,TGF-β_1组细胞的增殖率显著升高(P0.05),Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、α-SMA蛋白表达均显著上调(P0.05);与TGF-β_1组相比,TGF-β_1+Nrf_2 siRNA组细胞的增殖率升高,Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ及α-SMA蛋白表达上调。用DCL干预后,与DCL+TGF-β_1组相比,TGF-β_1+DCL+Nrf_2 siRNA组细胞增殖率也有所升高;Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ及α-SMA蛋白表达均显著升高(P0.05)。结论:1.DCL显著减轻博莱霉素诱导的小鼠PF。2.DCL有效抑制TGF-β_1诱导的HELF细胞PF模型程度。3.在BLM诱导PF小鼠及TGF-β_1诱导的HELF细胞PF模型中,DCL下调MDA和ROS水平、上调GSH和SOD水平,影响氧化应激水平。4.在BLM诱导PF小鼠模型和TGF-β_1诱导的HELF细胞PF模型中,DCL可以下调TGF-β_1、p-Smad_2、NOX_4蛋白表达,上调Nrf_2表达水平。5.在HELF转染敲低Nrf_2后,DCL干预不降低Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和和α-SMA蛋白的表达。
【图文】：
图 1.3 不同剂量 DCL 对实验性 BLM 诱导 PF 小鼠肺组织形态学的影响（HE 染色，，×100）图 1.4 不同剂量 DCL 对实验性 BLM 诱导 PF 小鼠肺组织炎症评分的影响(n=6, X±SD)***P<0.001 vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs BLM
天津医科大学硕士学位论文见大量蓝色胶原纤维增生维(P<0.05)。使用 DCL 和 PFD 以后，胶原纤维减少 PFD组、DCL各组与BLM组比较在第7天肺纤维化面积并没有出现统计学上的差异，在第 2 周和第 3 周天小鼠肺纤维化程度同时都比模型组明显降低(P<0.05)。结果表明 DCL 可以减少博莱霉素诱导肺纤维化的小鼠肺组织胶原纤维生成，抑制胶原沉积。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
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2610848
