三叶苷对过氧化氢诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2020-04-02 03:42

【摘要】：目的:观察三叶苷(TLB)对过氧化氢(H_2O_2)诱导的PC12细胞氧化应激损伤的神经保护作用,并探究其潜在机制。方法:通过H_2O_2诱导PC12细胞氧化应激损伤,N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为阳性对照药。将PC12细胞分为空白组(Control)、空白+TLB 60μM组、模型组(400μM H_2O_2)、模型+TLB 15μM组、模型+TLB 30μM组、模型+TLB60μM组、模型+NAC 20μM组、空白+AMPK抑制剂组(Compound C 10μM)、空白+TLB 60μM+AMPK抑制剂组、模型+AMPK抑制剂组、模型+TLB 60μM+AMPK抑制剂组、Nrf2转染组(Nrf2 siRNA)、Nrf2转染+TLB 60μM组、模型+Nrf2转染组、模型+TLB 60μM+Nrf2转染组、Nrf2转染阴性对照组(scrambled Nrf2 siRNA)、Nrf2转染阴性对照+TLB 60μM,AMPK抑制剂Compound C(10μM)在H_2O_2和TLB处理前1 h加入。采用MTT法检测细胞活力,LDH ELISA法检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)渗漏率、Hochest33324及流式细胞术检测细胞凋亡,DCFH-DA、Mito-SOX Red荧光染色、Rhodamine 123分别检测细胞内活性氧(ROS)、线粒体内ROS及线粒体膜电位(MMP),试剂盒检测Caspase 3/7活性、NAD~+/NADH比例、线粒体酶活性及ATP合酶活性,RT-PCR检测Sirt3 mRNA及mtDNA基因水平,Western blot检测Cyto c、Sirt3、FoxO3a、SOD2、ac-SOD2、GPx-1、IDH2、UCP2蛋白表达的变化。结果:模型组细胞活力较空白组明显降低,LDH渗漏率显著增加,细胞早期凋亡率明显升高,细胞内和线粒体内ROS水平升高,MMP降低,线粒体中Bax/Bcl-2比率显著降低而在胞浆中显著增加。此外,Cyto c蛋白表达、Caspase-3/7活力和MDA含量明显增加,而GPx、IDH2、SOD2、ATP活力及p-AMPK水平、ERRα、Sirt3、IDH2、FoxO3a、ac-SOD2、UCP2、GPx-1蛋白表达明显下降。而TLB作用48 h后较模型组可明显增加PC12细胞活力,显著减少LDH漏出率及细胞早期凋亡率及细胞内和线粒体内ROS含量,并恢复MMP。此外,TLB能明显增加线粒体中Bax/Bcl-2比率并降低胞浆中的Bax/Bcl-2比率、Cyto c含量和MDA含量,同时,升高GPx、IDH2、SOD2、ATP活力及p-AMPK水平、ERRα、Sirt3、IDH2、FoxO3a、ac-SOD2、UCP2、GP_X-1蛋白表达。值得注意的是,AMPK抑制剂或沉默Nrf2后可取消TLB的神经保护作用。结论:TLB对H_2O_2诱导的PC12细胞氧化应激损伤具有保护作用,其作用机制与AMPK/Nrf2/Sirt3信号通路调控介导的细胞内和线粒体内过多的ROS清除、抗氧化物酶活力提高,进而抑制细胞凋亡有关。
【图文】：

细胞,预处理,细胞氧化,渗漏率

遵义医科大学硕士学位论文吕纯著降低（接近 50%）[33]，因此将该浓度和孵育时间用于以下实验。为了探讨 TLB对 H2O2诱导 PC12 细胞损伤的影响，根据预实验结果，确定 PC12 细胞分别用 15、30、60 μM TLB 或 20 μM NAC 预处理 1 h 并继续与 H2O2共孵育 48 h，结果显示，TLB 能够在一定范围内浓度依赖性地显著降低 H2O2诱导的细胞死亡率（细胞活力分别为 66%、76%和 93%）[F（6,14） =65.682，P< 0.001]（图 1A）。同时，经TLB 预处理，PC12 细胞可显著降低 H2O2诱导的 LDH 渗漏（LDH 渗漏率分别为由34%降至 26%、20%及 14%）[F（6,14）=25.742，P<0.001]（图 1B）。此外，通过形态学观察可证实，经 H2O2处理的 PC12 细胞明显皱缩并悬浮于培养液中，而经 TLB 或 NAC 预处理的细胞则接近正常的形态（图 1C）。以上结果表明 TLB 可在 H2O2诱导的 PC12 细胞氧化应激损伤中抑制细胞死亡。

统计图,细胞质,早期凋亡,线粒体

23图 2 TLB 对 H2O2诱导的 PC12 细胞凋亡的影响。经不同浓度的 TLB（15、30、60 μM）预处理后，，用 400 μM H2O2处理 PC12 细胞 48 h。（A）Hoechst 33342 染色检测 H2O2诱导的 PC12细胞凋亡染色（标尺=50 μm）。（B）通过 Annexin V-FITC/PI 双染色及流式细胞术检测早期凋亡细胞。（C）早期凋亡细胞的定量。（D）Bax 和 Bcl-2 在细胞质和线粒体中的表达及 Cyto c在细胞质中的表达的代表性条带。（E）细胞质中的 Bax/Bcl-2 量化图。（F）线粒体中的 Bax/Bcl-2量化图。（G）Cyto c 统计图。（H）Caspase 3/7 活力。（x ± SD, n=3）**P<0.01vs 空白组；#P<0.05vs H2O2组；##P<0.01 vs H2O2组。Fig.2 Effect of TLB on H2O2-induced apoptosis in PC12 cells. After pre-treatment with different
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285

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